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Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.
Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.
Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas 1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares 1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que ....
Todo o tecido humano utilizado neste protocolo foi coletado de indivíduos que forneceram consentimento informado para a coleta de tecidos através de um estudo de coleta de tecido gástrico aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (IRB #842961). Os participantes deste estudo deveriam ser submetidos a uma endoscopia digestiva alta como parte de seus cuidados de rotina, ter pelo menos 18 anos de idade e ser capazes de fornecer consentimento informado. Todas as pesquisas realizadas se.......
Os resultados representativos subsequentes são derivados de biópsias retiradas do epitélio benigno das regiões do corpo gástrico e antro gástrico dos estômagos de cinco pacientes diferentes submetidos à endoscopia digestiva alta. Duas a quatro "cúpulas"/poços foram plaqueadas e analisadas por paciente para biópsias do corpo gástrico e do antro. Organoides foram gerados com sucesso a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia do antro gástrico de todos os cinco pacientes. Em média, 41 organoides foram an.......
Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minuto.......
Medicina Genômica da Universidade da Pensilvânia T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & Programa BRCA no Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
BZ-X710 | Keyence | n/a | |
cellSens | Olympus | n/a | |
Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
DPBS | Gibco | 14200-075 | |
Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel | Corning | 47743-715 | |
Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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