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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.

Abstract

Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.

Introduction

Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas 1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares 1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que ....

Protocol

Todo o tecido humano utilizado neste protocolo foi coletado de indivíduos que forneceram consentimento informado para a coleta de tecidos através de um estudo de coleta de tecido gástrico aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (IRB #842961). Os participantes deste estudo deveriam ser submetidos a uma endoscopia digestiva alta como parte de seus cuidados de rotina, ter pelo menos 18 anos de idade e ser capazes de fornecer consentimento informado. Todas as pesquisas realizadas se.......

Representative Results

Os resultados representativos subsequentes são derivados de biópsias retiradas do epitélio benigno das regiões do corpo gástrico e antro gástrico dos estômagos de cinco pacientes diferentes submetidos à endoscopia digestiva alta. Duas a quatro "cúpulas"/poços foram plaqueadas e analisadas por paciente para biópsias do corpo gástrico e do antro. Organoides foram gerados com sucesso a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia do antro gástrico de todos os cinco pacientes. Em média, 41 organoides foram an.......

Discussion

Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minuto.......

Disclosures

Os autores não têm divulgações relevantes.

Acknowledgements

Medicina Genômica da Universidade da Pensilvânia T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & Programa BRCA no Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
A83-01R&D Systems2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
Amphotericin BInvitrogen15290018
B27Invitrogen17504044
BZ-X710Keyencen/a
cellSensOlympusn/a
Collagenase IIIWorthingtonLS004182
Dispase IISigmaD4693-1G
Dithiothreitol (DTT)EMSCO/FisherBP1725
DPBSGibco14200-075
FunginInvivoGenNC9326704
Gastrin ISigma AldrichG9145
GentamicinInvitrogen1570060
GlutamaxGibco35050-061
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESInvitrogen15630080
hFGF-10Peprotech100-26
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
MatrigelCorning47743-715
MetronidazoleMP Biomedicals155710
N2 SupplementInvitrogen17502048
Noggin ELISA KitNovus BiologicalsNBP2-80296
Pen StrepGibco15140-122
RPMI 1640Gibco11875-085
R-Spondin ELISA KitR&D SystemsDY4120-05
Wnt-3a ELISA KitR&D SystemsDY1324B-05
Y-27632Sigma AldrichY0503

References

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020....

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