Установление и характеристика органоидов желудка, полученных от пациентов, из биопсии доброкачественного тела желудка и антрального эпителия

Summary

Органоиды, полученные от желудочных пациентов, находят все большее применение в исследованиях, однако формальные протоколы получения органоидов желудка человека из одноклеточных пищеварителей со стандартизированной плотностью посева отсутствуют. В данном протоколе представлен подробный метод надежного создания органоидов желудка из биопсийной ткани, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка.

Abstract

Органоиды, полученные от пациентов желудка (PDOs), предлагают уникальный инструмент для изучения биологии и патологии желудка. Следовательно, эти PDO находят все большее применение в широком спектре исследовательских приложений. Тем не менее, существует нехватка опубликованных подходов к получению желудочных ЗОП из одноклеточных дигестов при сохранении стандартизированной начальной плотности посева клеток. В этом протоколе акцент делается на инициации желудочных органоидов из изолированных единичных клеток и предоставлении метода пассации органоидов путем фрагментации. Важно отметить, что протокол демонстрирует, что стандартизированный подход к начальной плотности посева клеток последовательно дает органоиды желудка из доброкачественной биопсийной ткани и позволяет стандартизировать количественную оценку роста органоидов. Наконец, фактические данные подтверждают новое наблюдение о том, что желудочные ЗОП демонстрируют различную скорость образования и роста в зависимости от того, происходят ли органоиды из биопсии тела или антральных областей желудка. В частности, выявлено, что использование ткани антральной биопсии для инициации органоидов приводит к образованию большего количества органоидов и более быстрому росту органоидов в течение 20-дневного периода по сравнению с органоидами, полученными из биопсии тела желудка. Протокол, описанный в настоящем документе, предлагает исследователям своевременный и воспроизводимый метод успешного создания и работы с желудочными ЗОП.

Introduction

Органоиды представляют собой миниатюрные трехмерные (3D) клеточные структуры, которые напоминают архитектуру и функциональность органов, из которых они были получены ^1,2. Эти выращенные в лаборатории модели создаются путем культивирования стволовых клеток или тканеспецифичных клеток в контролируемой среде, которая позволяет этим клеткам самоорганизовываться и дифференцироваться в различные типы клеток ^1,2,3. Одним из ключевых преимуществ органоидов является их способность более точно повторять биологию человека, чем т....

Protocol

Все человеческие ткани, использованные в этом протоколе, были собраны у лиц, которые дали информированное согласие на забор тканей в рамках исследования сбора тканей желудка, одобренного Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании (IRB #842961). Участники этого исс?.......

Discussion

Изложен подробный протокол достоверной генерации органоидов желудка человека из единичных клеток, выделенных из биоптатов доброкачественного эпителия из тела желудка и антрума. Важнейшие этапы протокола связаны с синхронизацией, а также с обработкой матрицы базальной мембраны. Для ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503