Agradecemos a todos os membros do projeto de pesquisa, 'Co-criação de características adaptativas de plantas via montagem de holobionte de micróbio vegetal', por discussões frutíferas. Este trabalho foi apoiado por Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 e 21H05149 para A.M. e 21H05152 para Y.T.) e Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 para A. M.).

1. Plantas em crescimento
<ol><li>Para quebrar a dormência, ressuspenda sementes de A. thaliana (Col-0) em água deionizada e incube-as a 4 °C por 4 dias no escuro.</li>
	<li>Semeie as sementes no solo e cresça em uma câmara equipada com luz fluorescente branca. Manter as seguintes condições de crescimento: temperatura de 22 °C, intensidade luminosa de 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) por 10 h e umidade relativa de 60%.</li>
	<li>Quando necessário, regue as plantas com um fert...

Medição Automatizada da Resposta Estomática à Invasão Bacteriana em Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Estudos prévios utilizaram cascas epidérmicas, discos foliares ou folhas destacadas para investigar respostas estomáticas a invasões bacterianas 9,11,12. Em contrapartida, o método proposto neste estudo utiliza o aparelho portátil de imagem estomática para observar diretamente estômatos em uma folha aderida à planta após inoculação por atomização por atomização, mimetizando condições naturais de invas?...

Estômatos são poros microscópicos cercados por um par de células de guarda na superfície das folhas e outras partes aéreas das plantas. Em ambientes em constante mudança, a regulação da abertura estomática é fundamental para que as plantas controlem a absorção de dióxido de carbono necessária para a fotossíntese às custas da perda de água via transpiração. Assim, a quantificação da abertura estomática tem sido fundamental para o entendimento da adaptação ambiental das plantas. No entanto, quantificar a abertura estomática é inerentemente demorado e complicado, pois requer trabalho humano para detectar e medir poros estomáticos em uma imagem foliar capturada por um microscópio. Para contornar essas limitações, vários métodos têm sido desenvolvidos para facilitar a quantificação da abertura estomática em Arabidopsis thaliana, uma planta-modelo extensivamente utilizada para estudar a biologia estomática1,2,3,4,5,6. Por exemplo, um porômetro pode ser usado para medir a taxa de transpiração como uma métrica de condutância estomática. Entretanto, este método não fornece informações diretas sobre o número estomático e a abertura que determinam a condutância estomática. Alguns estudos utilizaram técnicas de microscopia confocal destacando poros estomáticos utilizando um marcador fluorescente de actina, um corante fluorescente ou autofluorescência da parede celular 1,2,3,4,5. Embora essas abordagens facilitem a detecção de estômatos, o custo de operar uma instalação de microscopia confocal e preparar amostras de microscopia pode ser um obstáculo para a aplicação de rotina. Em um trabalho pioneiro de Sai et al., um modelo de rede neural profunda foi desenvolvido para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens microscópicas de campo claro de peelings epidérmicos de A. thaliana 6. No entanto, essa inovação não isenta os pesquisadores da tarefa de preparar um peeling epidérmico para observação microscópica. Recentemente, esse obstáculo foi superado com o desenvolvimento de um aparelho portátil de imagem capaz de observar estômatos pinçando uma folha de A. thaliana, juntamente com um pipeline de análise de imagens baseado em aprendizado profundo que mede automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo7.
Os estômatos contribuem para a imunidade inata das plantas contra patógenos bacterianos. A chave para essa resposta imune é o fechamento estomático que restringe a entrada bacteriana através dos poros microscópicos no interior da folha, onde patógenos bacterianos proliferam e causam doenças8. O fechamento estomático é induzido pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs), moléculas imunogênicas que são frequentemente comuns a uma classe de micróbios, por receptores de reconhecimento de padrões localizados na membrana plasmática (PRRs)9. Um epítopo de 22 aminoácidos da flagelina bacteriana conhecido como flg22 é um MAMP típico que induz o fechamento estomático através do seu reconhecimento pelo PRR FLS210. Como contramedida, patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) e Xanthomonas campestris pv. vesicatórios desenvolveram mecanismos de virulência para reabrir estômatos9,11,12. Essas respostas estomáticas a patógenos bacterianos têm sido convencionalmente analisadas em ensaios nos quais cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas em suspensão bacteriana e, em seguida, estômatos são observados ao microscópio seguido de medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural que ocorre em uma folha aderida à planta.
Aqui, um método simples é apresentado para investigar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto sob a condição que mimetiza de perto a interação natural planta-bactéria. Este método utiliza o dispositivo portátil de imagem para observação direta de estômatos de A. thaliana em uma folha acoplada à planta inoculada com Pto, juntamente com a tubulação de análise de imagem para medição automatizada da abertura estomática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Os estômatos são poros microscópicos encontrados na epiderme foliar da planta. A regulação da abertura estomática é fundamental não apenas para equilibrar a absorção de dióxido de carbono para fotossíntese e perda de água transpiracional, mas também para restringir a invasão bacteriana. Enquanto as plantas fecham estômatos após o reconhecimento de micróbios, bactérias patogênicas, como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto), reabra os estômatos fechados para ter acesso ao interior da folha. Nos ensaios convencionais de avaliação das respostas estomáticas à invasão bacteriana, cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas sobre suspensão bacteriana e, em seguida, os estômatos são observados ao microscópio seguido da medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural em uma folha aderida à planta. Recentemente, foi desenvolvido um dispositivo portátil de imagem que pode observar estômatos pinçando uma folha sem desprendê-la da planta, juntamente com um pipeline de análise de imagem baseado em aprendizado profundo projetado para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo. Aqui, com base nesses avanços técnicos, um novo método para avaliar as respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana é introduzido. Este método consiste em três etapas simples: inoculação por atomização de Pto mimetizando processos naturais de infecção, observação direta de estômatos em uma folha da planta inoculada com Pto usando o dispositivo portátil de imagem e medição automatizada da abertura estomática pelo pipeline de análise de imagens. Este método foi usado com sucesso para demonstrar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto em condições que mimetizam a interação natural planta-bactéria.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa estomática com medição automatizada de abertura

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Após a inoculação por atomização do Pto, estômatos nas folhas aderidas às plantas inoculadas foram observados diretamente pelo aparelho portátil de imagem estomática. Usando medidas manuais e automatizadas, as mesmas imagens foliares foram usadas para calcular a abertura estomática, considerando razões entre largura e comprimento de aproximadamente 60 estômatos. Medidas manuais e automatizadas indicaram consistentemente uma diminuição na abertura estomática em plantas inoculadas com Pto e...

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Aqui, apresentamos um método simples para observação direta e medida automatizada das respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana. Esse método utiliza um dispositivo portátil de imagem estomática, juntamente com um pipeline de análise de imagem projetado para imagens foliares capturadas pelo dispositivo.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Os estômatos plantais desempenham papéis centrais na adaptação às condições de estresse, por isso precisamos medir a abertura dos estômatos para entender como as plantas respondem aos estresses bióticos e abióticos. No entanto, a medição da abertura dos estômatos é demorada e complicada. Para medir a abertura dos estômatos, descascamos a epiderme e observamos os estômatos ao microscópio.Em seguida, medimos manualmente a abertura dos estômatos, o que leva muito tempo, mesmo para pesquisadores muito experientes. Desafiamos essas barreiras e desenvolvemos uma ferramenta e uma técnica que podem medir automaticamente a abertura dos estômatos em folhas intactas de Arabidopsis. Portanto, acreditamos fortemente que o dispositivo de medição de estômatos e o algoritmo de aprendizado profundo que desenvolvemos facilitarão a análise funcional das respostas dos estômatos a vários estresses bióticos e abióticos, porque esses avanços técnicos reduzem significativamente o tempo e o trabalho humano necessários para a medição da abertura dos estômatos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Abstract