شكرا لروزانا كالديرون ودومينيك شيلر وروزا سييرا على المشورة الفنية. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة غير مقيدة لقسم طب العيون في كلية الطب بجامعة جنوب كاليفورنيا كيك من البحث لمنع العمى (AN) ، المعاهد الوطنية للصحة K08EY030924 (AN) ، وقف لاس مادريناس في العلاجات التجريبية لطب العيون (AN) ، بحث لمنع العمى جائزة التطوير الوظيفي (AN) ، مؤسسة فرسان الهيكل للعيون (AN) ، ومؤسسة إدوارد ن. وديلا إل ثوم التذكارية (AN، KG).

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة جنوب كاليفورنيا. تم استخدام أربعة عشر (ن = 14) أرنب هولندي أحزمة تتراوح أعمارهم بين 4 و 6 أشهر في تطوير هذا البروتوكول. تم استخدام كل من من الذكور والإناث. تزن جميع ما بين 2.0 و 2.5 كجم. تم إيواء جميع بشك...

تشريح عين الأرنب والتشريح بالتبريد لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية

<ol>
	<li>Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19-Models+in+ophthalmology+and+vision+research.">Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research.</a> American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).</li><li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit.">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li><li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+models+of+ocular+diseases:+New+relevance+for+classical+approaches.">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS &amp; Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology,+immunofluorescence,+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing.">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).</li><li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies.">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+in+companion+animals.">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li><li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs.">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).</li><li>Baiza-Dur&#225;n, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+(PRO-169)+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits.">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits.">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li><li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit.">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li></ol>

قبل تنفيذ البروتوكول أعلاه ، واجهنا باستمرار صعوبات في معالجة أنسجة عيون الأرانب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. لقد قمنا بتكييف العديد من البروتوكولات من عيون الصغيرة مثل الفئران ، لكننا وجدنا أنها تؤدي إلى عدم كفاية التثبيت وصعوبة تقسيم الأنسجة. هناك العديد من الاعتبارات المهمة ا?...

تتكون شبكية العين من عدة طبقات من الخلايا المتخصصة داخل العين التي تعمل معا على تحويل الضوء إلى إشارات عصبية. نظرا لأن شبكية العين تلعب دورا مهما في الرؤية ، فإن فهم هيكلها ووظيفتها يمكن أن يوفر رؤى قيمة لبعض الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر مثل الضمور البقعي واعتلال الشبكية السكري ، من بين أمور أخرى.
تعمل الأرانب كنموذج حيواني مناسب في أبحاث الشبكية لأنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى. عيون الأرنب متشابهة نسبيا في علم التشريح مع عيون الإنسان 1,2. على سبيل المثال ، الأرانب لديها مساحة من كثافة مستقبلات الضوء المتزايدة ، والمعروفة باسم الخط البصري الأفقي ، والتي تشبه النقرة في البشر. النماذج الحيوانية الأخرى شائعة الاستخدام ، مثل القوارض ، ليس لها مكافئ تشريحي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع القوارض ، فإن الأوعية الدموية في شبكية العين في الأرانب تشبه إلى حد ما تلك الموجودة في البشر. عيون الأرنب كبيرة نسبيا أيضا. هذا يجعلها مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تنطوي على إعطاء الدواء أو التدخل الجراحي داخل الجسم الزجاجي أو شبكية العين التي قد تكون صعبة أو مستحيلة في عين أصغر3.
الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة توطين المستضدات داخل الأنسجة ولها تطبيقات واسعة في أبحاث الشبكية4،5،6. نظرا لأن شبكية العين عبارة عن بنية دقيقة ، فإن الحصول على نتائج مفيدة عبر IHC يتطلب معالجة دقيقة للأنسجة. يحدث انفصال الشبكية وقطع الأنسجة الأخرى مثل فواصل الشبكية أو طياتها بشكل شائع أثناء المعالجة وقد تتداخل مع تفسير النتائج. تعتمد المعالجة الناجحة على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، ونوع التثبيت ومدته ، ونوع وسائط التضمين ، وتقنيات التقسيم7،8،9،10. على الرغم من مزايا استخدام الأرانب كنموذج حيواني في أبحاث الشبكية ، يوجد عدد قليل جدا من البروتوكولات التي تصف المعالجة الناجحة لأنسجة شبكية العين. تصف هذه الورقة طريقة موثوقة للحصول على أقسام شبكية عالية الجودة من عيون الأرنب الكاملة لاستخدامها في IHC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-106</td>
			<td>For fixation and cryoprotection (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Cover</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SOX2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-profile disposable cryostat blades</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>14035838926</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td>Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-RPE65</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NB100-355SS</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>167117</td>
			<td>Used for cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td>Used as embedding mold (step 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 15</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Used as embedding media (step 6)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eye 

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على عمليات تجميد شبكية عالية الجودة في الكبيرة ، مثل الأرانب. بعد الاستئصال ، تغمر العين لفترة وجيزة في المثبت. بعد ذلك ، تتم إزالة القرنية والقزحية وتترك العين طوال الليل لتثبيت إضافي عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تتم إزالة العدسة. ثم توضع العين في cryomold وتملأ بوسط التضمين. عن طريق إزالة العدسة ، يتمتع وسيط التضمين بوصول أفضل إلى الجسم الزجاجي ويؤدي إلى استقرار أفضل للشبكية. الأهم من ذلك ، يجب تحضين العين في وسط التضمين طوال الليل للسماح بالتسلل الكامل في جميع أنحاء الجسم الزجاجي. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تجميد العين على الثلج الجاف وتقسيمها. يمكن الحصول على أقسام شبكية كاملة لاستخدامها في الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن استخدام بروتوكولات التلوين القياسية لدراسة توطين المستضدات داخل أنسجة الشبكية. يؤدي الالتزام بهذا البروتوكول إلى عمليات تجميد شبكية عالية الجودة يمكن استخدامها في أي تجربة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية.

The retina is composed of several layers of specialized cells within the eye that together work to convert light into neural signals. Because the retina plays a critical role in vision, understanding its structure and function can provide valuable insights into some of the most common causes of vision loss such as macular degeneration and diabetic retinopathy, among others.
Rabbits serve as a convenient animal model in retinal research as they offer several advantages compared to other models. Rabbit eyes are relatively similar in anatomy to human eyes1,2. For example, rabbits have an area of increased photoreceptor density, known as the horizontal visual streak, that is analogous to the fovea in humans. Other commonly used animal models, such as rodents, do not have an anatomic equivalent. In addition, compared to rodents, the retinal vasculature in rabbits is fairly similar to that in humans. Rabbit eyes are relatively large as well. This makes them particularly suitable for studies that involve drug administration or surgical intervention within the vitreous or retina that may otherwise be difficult or impossible in a smaller eye3.
Immunohistochemistry (IHC) is a widely used technique to study the localization of antigens within a tissue and has broad applications in retinal research4,5,6. Because the retina is a delicate structure, obtaining useful results via IHC requires careful tissue processing. Retinal detachment and other tissue artifacts such as retinal breaks or folds commonly occur during processing and may interfere with the interpretation of results. Successful processing depends on a variety of factors, including tissue manipulation, type and duration of fixation, type of embedding media, and sectioning techniques7,8,9,10. Despite the advantages of using rabbits as an animal model in retinal research, very few protocols describing successful tissue processing of the rabbit retina exist. This paper describes a reliable method for obtaining high-quality retinal sections from whole rabbit eyes for use in IHC.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معالجة أنسجة الشبكية للكيمياء المناعية في نماذج الأرانب

الحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعين الأرنب الكاملة 

Our research focuses on novel approaches to regenerating the retinal pigment epithelium. Dysfunction of the retinal pigment epithelium is thought to play a central role in the pathophysiology of many eye diseases, such as macular degeneration, so regenerating this layer of cells is attractive from a therapeutic standpoint. Visualizing the structural anatomy of the retina via immunohistochemistry has wide applications in retinal research.In our laboratory, we found obtaining useful results from rabbit eyes, difficult due to tissue artifacts like retinal attachments and retinal folds. Despite these challenges, there are very few protocols existing that describe successful tissue processing of rabbit retina. This protocol makes several important modifications to standard tissue processing techniques that result in excellent tissue sections of the rabbit retina.This study may allow researchers to obtain better results from their research that involves the use of immunohistochemistry in rabbit models.

بعد معالجة الأنسجة ، يمكن استخدام بروتوكول التألق المناعي القياسي للتحقيق في أي عدد من العمليات البيولوجية داخل شبكية العين. يوضح الشكل 3A-C صورا مضان تمثيلية لقسم شبكية تم الحصول عليه عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. تم تلطيخ قسم الشبكية بالمناعة وفقا ل?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Optimizing Retinal Tissue Processing for Immunohistochemistry in Rabbit Models at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعيون الأرانب الكاملة. إنه يفصل تشريح عين الأرنب ، والتثبيت ، والتضمين ، وإجراءات التقسيم ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاستخدامها في أي دراسة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عيون أكبر.

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

يركز بحثنا على مناهج جديدة لتجديد ظهارة الشبكية الصبغية . يعتقد أن الخلل الوظيفي في ظهارة الشبكية الصبغية يلعب دورا مركزيا في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العيون ، مثل الضمور البقعي ، لذا فإن تجديد هذه الطبقة من الخلايا أمر جذاب من وجهة نظر علاجية. إن تصور التشريح الهيكلي لشبكية العين عبر الكيمياء الهيستولوجية المناعية له تطبيقات واسعة في أبحاث الشبكية.في مختبرنا ، وجدنا الحصول على نتائج مفيدة من عيون الأرانب ، صعبا بسبب القطع الأثرية للأنسجة مثل مرفقات الشبكية وطيات الشبكية. على الرغم من هذه التحديات ، هناك عدد قليل جدا من البروتوكولات الموجودة التي تصف المعالجة الناجحة للأنسجة في شبكية العين. يقوم هذا البروتوكول بإجراء العديد من التعديلات المهمة على تقنيات معالجة الأنسجة القياسية التي تؤدي إلى أقسام أنسجة ممتازة في شبكية العين للأرانب.قد تسمح هذه الدراسة للباحثين بالحصول على نتائج أفضل من أبحاثهم التي تتضمن استخدام الكيمياء المناعية في نماذج الأرانب.

الحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعين الأرنب الكاملة

Abstract