השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג קריוסקציות רשתית באיכות גבוהה בבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות. לאחר האינוקלציה, העין שקועה לזמן קצר בקיבוע. לאחר מכן, הקרנית והקשתית מוסרים והעין נשארת לילה לקיבוע נוסף ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העדשה מוסרת. לאחר מכן מכניסים את העין לקריומולד וממלאים אותה במדיום הטבעה. על ידי הסרת העדשה, למדיום ההטבעה יש גישה טובה יותר לזגוגית ומוביל ליציבות רשתית טובה יותר. חשוב לציין, יש לדגור את העין בהטבעה בינונית למשך הלילה כדי לאפשר חדירה מלאה לכל הזגוגית. לאחר הדגירה בלילה, העין קפואה על קרח יבש ונחתכת. ניתן להשיג קטעי רשתית שלמים לשימוש באימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים כדי לחקור את הלוקליזציה של אנטיגנים ברקמת הרשתית. היצמדות לפרוטוקול זה מביאה לקריוסקציות רשתית באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן בכל ניסוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

הרשתית מורכבת מכמה שכבות של תאים מתמחים בתוך העין שיחד פועלים להמרת אור לאותות עצביים. מכיוון שהרשתית ממלאת תפקיד קריטי בראייה, הבנת המבנה והתפקוד שלה יכולה לספק תובנות חשובות לגבי כמה מהגורמים הנפוצים ביותר לאובדן ראייה כגון ניוון מקולרי ורטינופתיה סוכרתית, בין היתר.

ארנבים משמשים כמודל נוח לבעלי חיים במחקר רשתית מכיוון שהם מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים. עיני ארנב דומות יחסית באנטומיה לעיניים אנושיות ^1,2. לדוגמה, לארנבים יש אזור של צפיפות פוטורצפטור מוגברת, המכונה פס חזותי אופקי, המקביל לגומה המרכזית בבני אדם. למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים, כגון מכרסמים, אין מקבילה ....

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קליפורניה. 14 (n = 14) ארנבים בעלי חגורה הולנדית בגילאי 4 עד 6 חודשים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה. נעשה שימוש בבעלי חיים זכרים ונקבות כאחד. כל בעלי החיים שקלו בין 2.0 ל -2.5 ק"ג. כל בעלי החיים שוכנו ביחיד.......

Discussion

לפני יישום הפרוטוקול הנ"ל, נתקלנו באופן עקבי בקשיים בעיבוד רקמות של עיני ארנב עבור IHC. התאמנו כמה פרוטוקולים מעיניהם של בעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים, אך מצאנו שהם מובילים לקיבוע לקוי ולקושי בחיתוך רקמות. ישנם מספר שיקולים חשובים המאפשרים חלקים עקביים ואיכותיים של רשתית הארנבת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)