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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell'occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l'uso in qualsiasi studio che utilizza l'immunoistochimica negli occhi più grandi.

Abstract

Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l'enucleazione, l'occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l'iride vengono rimosse e l'occhio viene lasciato per una notte per un'ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L'occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l'occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l'incubazione notturna, l'occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l'uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno del tessuto retinico. L'adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l'immunoistochimica.

Introduction

La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all'interno dell'occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.

I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell'anatomia agli occhi umani

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Southern California. Quattordici (n = 14) conigli con cintura olandese di età compresa tra 4 e 6 mesi sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo. Venivano utilizzati sia animali maschi che femmine. Tutti gli animali pesavano tra 2,0 e 2,5 kg. Tutti gli animali erano alloggiati singolarmente. Un elenco dei materiali e delle attrezzature consigliate è disponibile ne.......

Representative Results

Dopo l'elaborazione dei tessuti, un protocollo standard di immunofluorescenza può essere utilizzato per studiare un numero qualsiasi di processi biologici all'interno della retina. Le figure 3A-C illustrano immagini a fluorescenza rappresentative di una sezione retinica ottenute tramite microscopia confocale. La sezione retinica è stata immunocolorata secondo un protocollo12 precedentemente descritto.

Le .......

Discussion

Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l'elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l'IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.

Una considerazion.......

Acknowledgements

Grazie a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra per la consulenza tecnica. Questo studio è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia presso la USC Keck School of Medicine dalla ricerca per prevenire la cecità (AN), NIH K08EY030924 (AN), il Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), un premio per lo sviluppo della carriera (AN) per la ricerca per prevenire la cecità, Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e la Edward N. e Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm culture dishCorning353025Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tubeGenesee Scientific28-106For fixation and cryoprotection (step 1)
CryostatLeicaCM1850For cryosectioning (step 7)
Curved scissorsFine Science Tools91500-09Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPIFisher ScientificD3571Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscopeZeissStemi 2000-CUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488Fisher ScientificA-11055Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555Fisher ScientificA-31570Diluted 1:1,000 in blocking buffer
ForcepsFine Science Tools91150-20Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide CoverVWR48404-453For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2R&D SystemsAF2018Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat bladesLeica Microsystems Inc.14035838926For cryosectioning (step 7)
KimwipeFisher Scientific06-666-AUsed to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65Novus BioNB100-355SSDiluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur SucroseMillipore167117Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solutionElectron Microscopy Sciences15713Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)Polysciences, Inc.18646AUsed as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1xCorning21-030-CVUsed in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15Feather08-916-5DUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Used as embedding media (step 6)

References

  1. Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
  2. Davis, F. A.

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