מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

Summary

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

Abstract

סגירת צינור עצבי (NTC) היא תהליך קריטי במהלך ההתפתחות העוברית. כישלון בתהליך זה עלול להוביל למומים בתעלה העצבית, ולגרום למומים מולדים או אפילו לתמותה. NTC כוללת סדרה של מנגנונים ברמה גנטית, מולקולרית ומכנית. בעוד רגולציה מכנית הפכה לנושא אטרקטיבי יותר ויותר בשנים האחרונות, היא נותרה במידה רבה לא נחקרת בשל היעדר טכנולוגיה מתאימה לביצוע בדיקות מכניות של רקמות עובריות תלת ממדיות באתרן. בתגובה, פיתחנו פרוטוקול לכימות התכונות המכניות של רקמה עוברית של תרנגולת באופן לא מגע ולא פולשני. זה מושג על ידי שילוב מיקרוסקופ Brillouin קונפוקלי עם מערכת דגירה על הבמה. כדי לחקור את מכניקת הרקמות, עובר טרום תרבית נאסף ומועבר לאינקובטור על הבמה לתרבית אקס אובו . במקביל, התמונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית נרכשות על ידי מיקרוסקופ ברילואין בנקודות זמן שונות במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה כולל תיאורים מפורטים של הכנת דגימות, יישום ניסויים במיקרוסקופ ברילואין, ונתונים לאחר עיבוד וניתוח. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור את האבולוציה המכנית של רקמה עוברית במהלך ההתפתחות לאורך זמן.

Introduction

מומים בתעלה העצבית (NTDs) הם מומים מולדים חמורים של מערכת העצבים המרכזית הנגרמים על ידי כשלים בסגירת הצינור העצבי (NTC) במהלך ההתפתחות העוברית¹. האטיולוגיה של NTDs מורכבת. מחקרים הראו כי NTC כרוך ברצף של תהליכים מורפוגנטיים, כולל הרחבה מתכנסת, כיפוף של הלוח העצבי (למשל, התכווצות אפית), העלאת הקפל העצבי, ולבסוף היצמדות של הקפל העצבי. תהליכים אלה מוסדרים על ידי מנגנונים מולקולריים וגנטיים מרובים ^2,3, וכל תקלה בתהליכים אלה עלולה לגרום NTDs ^4,5,6. ככל שהראיות המצטברות מצביעות ....

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וויין סטייט.

1. הכנה ניסיונית

1. השתמש בתמיסת אתנול 70% כדי לנקות ולעקר את המספריים והפינצטה. כמו כן, להכין פיפטות חד פעמיות מזרק.
2. הכינו מדיום שטיפה על ידי הוספת 3.595 גרם של NaCl ל 495 מ"ל של.......

Discussion

ההתפתחות המוקדמת של העובר יכולה להיות מושפעת בקלות מהפרעות חיצוניות. לכן, נדרשת זהירות מרבית במהלך שאיבת הדגימה והעברתה. בעיה פוטנציאלית אחת היא ניתוק העובר מנייר הפילטר, מה שעלול להוביל להתכווצות קרום הוויטלין ולגרום לממצא מוטה של הצלחת העצבית בדימות ברילואין. יתר על כן, התכווצות זו עלו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set