Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Summary

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Abstract

O fechamento do tubo neural (NTC) é um processo crítico durante o desenvolvimento embrionário. A falha nesse processo pode levar a defeitos do tubo neural, causando malformações congênitas ou mesmo mortalidade. As NTC envolvem uma série de mecanismos em níveis genéticos, moleculares e mecânicos. Embora a regulação mecânica tenha se tornado um tópico cada vez mais atraente nos últimos anos, ela permanece em grande parte inexplorada devido à falta de tecnologia adequada para a realização de testes mecânicos de tecido embrionário 3D in situ. Em resposta, desenvolvemos um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas do tecido embrionário de galinhas de forma não invasiva e sem contato. Isto é conseguido através da integração de um microscópio Brillouin confocal com um sistema de incubação no palco. Para sondar a mecânica dos tecidos, um embrião pré-cultivado é coletado e transferido para uma incubadora no palco para cultura ex ovo . Simultaneamente, as imagens mecânicas do tecido da placa neural são adquiridas pelo microscópio Brillouin em diferentes momentos do desenvolvimento. Este protocolo inclui descrições detalhadas da preparação da amostra, a implementação de experimentos de microscopia de Brillouin e o pós-processamento e análise dos dados. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores podem estudar longitudinalmente a evolução mecânica do tecido embrionário durante o desenvolvimento.

Introduction

Os defeitos do tubo neural (DTN) são graves defeitos congênitos do sistema nervoso central causados por falhas no fechamento do tubo neural (NTC) durante o desenvolvimento embrionário¹. A etiologia dos DTNs é complexa. Estudos têm mostrado que as NTC envolvem uma sequência de processos morfogenéticos, incluindo extensão convergente, flexão da placa neural (por exemplo, constrição apical), elevação da prega neural e, finalmente, adesão da prega neural. Esses processos são regulados por múltiplos mecanismos moleculares e genéticos ^2,3, e qualquer mau funcionamento de....

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Wayne State University.

1. Preparação experimental

1. Use uma solução de etanol a 70% para limpar e esterilizar a tesoura e pinça. Além disso, prepare pipetas descartáveis e uma seringa.
2. Preparar um meio de lavagem adicionando 3,595 g de NaCl a 495 mL de água deionizada. Em seguida, adicionar 5 ml de Penicilina-Estreptomicina (5 U/mL) ao meio. Encha uma placa de Petri d.......

Discussion

O desenvolvimento inicial do embrião pode ser facilmente afetado por distúrbios externos. Portanto, é necessário o máximo de cautela durante a extração e transferência da amostra. Um problema potencial é o descolamento do embrião do papel de filtro, o que pode levar ao encolhimento da membrana vitelínica e resultar em um artefato inclinado da placa neural na imagem de Brillouin. Além disso, esse encolhimento pode interromper o desenvolvimento do embrião. Deve-se prestar atenção a várias etapas críticas p.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set