בדיקת הגנה פותחה כדי לעקוב אחר עמידות כלי הדם ברשתית למוות מעלבונות הקשורים לסוכרת / רטינופתיה סוכרתית כגון מתח חמצוני וציטוקינים.
רטינופתיה סוכרתית (DR) היא מחלת עיניים מורכבת ומתקדמת המאופיינת בשני שלבים שונים בפתוגנזה שלה. השלב הראשון כולל את אובדן ההגנה מפני נזק הנגרם על ידי סוכרת לרשתית, ואילו השלב השני מתמקד בהצטברות של נזק זה. הבדיקות המסורתיות מתמקדות בעיקר בהערכת ניוון נימי, המעיד על חומרת הנזק, ולמעשה מתייחסות לשלב השני של DR. עם זאת, הם רק מספקים בעקיפין תובנות האם מנגנוני ההגנה של כלי הדם ברשתית נפגעו. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פותחה גישה חדשנית להערכה ישירה של מנגנוני ההגנה של הרשתית - בפרט, עמידותה מפני עלבונות הנגרמים על ידי סוכרת כמו עקה חמצונית וציטוקינים. בדיקת הגנה זו, למרות שתוכננה בתחילה עבור רטינופתיה סוכרתית, טומנת בחובה פוטנציאל ליישומים רחבים יותר הן בהקשרים פיזיולוגיים והן בהקשרים פתולוגיים. לסיכום, הבנת הפתוגנזה של רטינופתיה סוכרתית כרוכה בהכרה בשלבים הכפולים של אובדן הגנה והצטברות נזקים, כאשר בדיקת הגנה חדשנית זו מציעה כלי רב ערך למחקר ועשויה להתרחב למצבים רפואיים אחרים.
רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחד הסיבוכים המיקרו-וסקולריים של סוכרת (DM), והגורם המוביל לעיוורון בקרב אנשים בגיל העבודה במדינות מפותחות1. גורמי הסיכון העיקריים לרטינופתיה סוכרתית הם משך ודרגת היפרגליקמיה 2,3,4. בעוד DM גורם לתפקוד לקוי של המרכיבים הווסקולריים והעצביים של הרשתית5, אבחון DR מבוסס על תכונות מורפולוגיות של כלי הדם ברשתית6.
עקה חמצונית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה היא אחד הגורמים לפתוגנזה DR7. עקה חמצונית מוגברת גורמת לנזק נרחב, אשר פוגע בתפקוד המיטוכונדריה ובכך מעלה עוד יותר את רמת מיני החמצן הריאקטיביים. אירועים אלה מלווים בדליפה של כלי דם ברשתית, עלייה ברמת הציטוקינים הדלקתיים, ומוות של תאים עצביים וכלי דם בתוך הרשתית. אובדן תאי כלי הדם, ומכאן הפונקציונליות של רשת הנימים הנרחבת של הרשתית, גורם להיפוקסיה, גירוי רב עוצמה למגוון תגובות5. תגובות אלה כוללות ביטוי מוגבר של גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) המניע הן חדירות והן אנגיוגנזה, תכונות קרדינליות של השלבים המתקדמים ומסכני הראייה של DR - בצקת מקולרית סוכרתית, ורטינופתיה סוכרתית שגשוגית6.
תכונות מסוימות של DR מצביעות על כך שלאורגניזם (הן חולים והן חיות ניסוי) יש יכולת פנימית להתנגד להתוויה זו. חולים חווים כמה עשורים של DM לפני שהם מפתחים DR 8,9,10,11,12,13 מסכן ראייה. בעוד מודלים מכרסמים של DM אינם מפתחים את השלבים המתקדמים ומסכני הראייה של DR14, הצורה הראשונית/קלה של DR המתבטאת עושה זאת רק לאחר תקופה של שבועות או חודשים של DM15,16. יתר על כן, הן בחולים והן בחיות ניסוי, DR הוא פרוגרסיבי, ותפקוד לקוי / נזק ברשתית גדל ככל שמשך DM ממושך. לבסוף, חלק מהחולים עם DM לעולם אינם מפתחים DR. במקרים מסוימים, הסיבה לכך היא שאנשים כאלה אינם חווים סוכרת מספיק זמן כדי לפתח DR. במקרים אחרים, הסיבה לכך היא שהם מפגינים התנגדות יוצאת דופן ל- DR; כמו במקרה של משתתפי המחקר Medalist, שאינם מפתחים DR לאחר 50 שנים או יותר של DM17. למרות תמיכה משכנעת כזו בקיומה של הגנה מפני DR והרלוונטיות התרגומית העצומה שלה, המנגנון העומד בבסיס ההגנה לא נחקר באגרסיביות.
בדיקת ההגנה המתוארת כאן פותחה כדי להקל על חקירת הסיבה לכך ש- DR מתעכב מתחילת DM בעכברים סוכרתיים. השלבים העיקריים של בדיקה זו, המיושמים על עכברי DM ועכברים שאינם DM, כוללים (1) מתן עלבון תת-מקסימלי הגורם למוות לעין (ex vivo או in vivo), (2) בידוד כלי הדם ברשתית, (3) צביעת כלי הדם באמצעות TUNEL ו-DAPI, (4) צילום התמונות המתקבלות וכימות אחוז המינים החיוביים הכפולים TUNEL/DAPI.
כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי המשרד לטיפול בבעלי חיים ובטיחות ביולוגית מוסדית באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. עכברי C57/BL6/J זכרים בני שבעה שבועות שוכנו בכלובים קבוצתיים בסביבה נטולת פתוגנים במחזור של 12 שעות אור/חושך וסיפקו גישה חופשית למזון ומים. עכברים הומתו על ידי חנקCO2 , והעיניים עברו חניכה ועיבוד מיידי18. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). הכלים החיוניים הדרושים למחקר מתוארים באיור 1.
1. מסירת העלבון הגורם למוות
2. בידוד רשתית
3. בידוד כלי דם ברשתית
4. הרכבת כלי הדם הרשתית המבודדים על שקופית מיקרוסקופ
5. זיהוי מוות עם צביעת טונל
הערה: לקבלת פרטים על הליך זה, עיין ב- Zheng et al.21. תמונות מייצגות של איסכמיה +/- גופים אפופטוטיים הנגרמים על ידי לחץ שור בכלי דם רשתית מבודדים מתוארים באיור 3.
הבידוד המוצלח של כלי הדם ברשתית גורם להרכבה שטוחה של כל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שלמות אדריכלית שלמה (איור 2J). לאחר צביעה בהמטוקסילין חומצי-שיף תקופתי (PASH), ניתן להבחין בין שני סוגי תאי כלי הדם: תאי אנדותל (ECs) ופריציטים (PC) (איור 6). גרעיני תאי האנדותל מוארכים, מוכתמים קלות ושוכנים כולם בתוך דפנות כלי הדם. גרעיני פריציטים הם עגולים, מוכתמים בצפיפות ובולטים מדפנות הנימים. הדגימות המוכתמות ב-PASH חושפות גם נימים אצלולריים, חסרי גרעינים.
הגישה לגרימת מוות הונחה על ידי הרציונל הבא. הועלתה השערה כי ההגנה מוגבלת, כלומר, עלולה להיות מוכרעת על ידי עלבון חזק מאוד הגורם למוות. כתוצאה מכך, עלבונות (גם איסכמיה/עקה חמצונית וגם ציטוקינים18) עברו אופטימיזציה כך שהם יגרמו לעלייה קלה לזיהוי, אך עם זאת להיקף תת-מקסימלי של מוות (איור 3 ואיור 5).
חשוב להדגיש כי נוכחותם של גרעינים חיוביים ל-TUNEL הייתה מותנית בסוג העלבון הספציפי שהופעל כדי לגרום למוות תאי. עלבון האיסכמיה/העקה החמצונית הוביל לדפוס של אפופטוזיס תאי, כפי שמודגם באיור 3, בעוד שעלבון הציטוקינים הביא לדפוס ברור ומוגדר היטב, כפי שמתואר באיור 5. ניתן לראות את שני הדפוסים בכלי דם ברשתית מחולי DR22, דבר המצביע על כך ששני סוגי הסוכנים גורמים למוות תאי בבני אדם. יתר על כן, ההבחנות המורפולוגיות הנצפות מציעות אמצעי להעריך אם הפתולוגיה הונעה על ידי עקה חמצונית או ציטוקינים.
איור 1: כלים לבידוד כלי דם ברשתית עכבר. משמאל לימין: קלטת ההרכבה, שתי מברשות שיער בודדות, צינור העברה הפוך, מיקרו-מרית, שני מלקחיים מעוקלים, מספריים קפיציים, מיקרו-סכין ומלקחיים עם קצוות ישרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמטי המראה את שלבי המפתח של העברת עלבון הגורם למוות ולאחר מכן בידוד כלי הדם ברשתית מעין עכבר. (A) השראת איסכמיה/פגיעה חמצונית, ex vivo. לאחר enucleation, גלגל העין נתון איסכמיה בנוכחות TBH. (B) מתן In vivo (הזרקה תוך ויטריאלית) של ציטוקינים. (ג) חיתוך גלגל העין לשני חצאים. (D) עיכול אנזימי ברשתית: הסרת לובן העין ושטיפת הרשתית במים מזוקקים פעמיים למשך הלילה. דגירה בתמיסת טריפסין YL ב 37 ° C במשך 4 שעות 15 דקות בבאר של צלחת 24 באר. (ה) הסרת הפוטורצפטורים. (F) הסרת הרקמה העצבית והרקמה הגליה הנותרת. (G) רשת כלי דם בצורת קערה מנוקה הפונה כלפי מעלה. (H) רשת כלי דם מבודדת בכלי 35 מ"מ עם רקע שחור על במת מיקרוסקופ מנתח. (I) כלי דם ברשתית שטוחים על מגלשה. (J) כלי דם רשתית מיובשים באוויר במגלשה. נתון זה שונה מ Li et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי גופים אפופטוטיים בתוך כלי דם ברשתית עכבר שטופלו ex vivo עם איסכמיה +/- TBH. תמונות מייצגות של איסכמיה +/- גופים אפופטוטיים הנגרמים על ידי לחץ שור בכלי רשתית מבודדים. הכותרת של כל עמודה מציינת את הצביעה. (א-ג) כלי רשתית מבודדים מגלגלי עיניים שעברו 1 שעה של איסכמיה בלבד. (ד-ו) כמו (A-C), למעט העלבון של 1 שעות היה שילוב של איסכמיה ועקה חמצונית (5 mM TBH). החיצים האדומים מצביעים על מינים חיוביים כפולים מייצגים של TUNEL/DAPI. (ז-י) בקרה חיובית מטופלת ב- DNase. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מ Li et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איור של בחירת שדה לכימות תוצאות. סריקת אריחים בגודל 5 x 5 של כלי הדם ברשתית עם מיזוג של TUNEL ואות DAPI. הבחירה של שישה עד שמונה שדות בפריפריה הרחוקה המקיפה את עצב הראייה מוצגת עם ריבועים אדומים. הגדלה, פי 200. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: זיהוי גופים אפופטוטיים בתוך כלי הדם ברשתית של עכבר בתגובה להזרקה תוך-ויטריאלית של ציטוקינים (מתן in vivo). תמונות מייצגות של גופים אפופטוטיים הנגרמים על ידי ציטוקינים בכלי דם רשתית מבודדים. הכותרת של כל עמודה מציינת את הצביעה. (א-ג) תמונות של כלי הדם ברשתית שבודדו מעכברים שהוזרקו עם PBS. (ד-ו) כמו (A-C), למעט קוקטייל ציטוקינים הוזרק יחד עם PBS. החיצים האדומים מצביעים על מינים חיוביים לטונל. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ Li et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונה מייצגת של כלי דם ברשתית מוכתמים ב-PASH. כלי דם ברשתית של עכבר שחוו 20 שבועות של DM המושרה על ידי STZ בודדו כמתואר באיור 2, הוכתמו ב-PASH וצולמו כשהם מוארים באור נראה. גרעיני פריציטים בנימים נוטים להיות עגולים יותר ומוכתמים בצפיפות רבה יותר (חיצים כחולים), ואילו גרעינים מוארכים ומוכתמים פחות בצפיפות מאבחנים תאי אנדותל (חיצים אדומים). החץ הצהוב מצביע על נימים אצלולריים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
במחקר זה, בדיקה הוקמה כדי לזהות התנגדות / פגיעות של כלי הדם ברשתית למוות המושרה על ידי עלבונות הקשורים DM / DR כגון איסכמיה / מתח חמצוני וציטוקינים. כתב יד זה מספק תיאור מפורט של בדיקה זו, שהיא שינוי של כמה פרוטוקולים שפורסמו 19,20,21.
הפרוטוקול מקיף מספר שלבים מכריעים. ראשית, חובה לנתח בקפידה את הרשתית, להבטיח את שימור רשת כלי הדם ולמנוע קרעים משמעותיים. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע חתך 2-3 מ"מ אחורי ללימבוס מכיוון שהרשתית נצמדת בחוזקה לאורה סראטה, והפרדתה מאתגרת. שנית, יש לצפות את כל המכשירים הבאים במגע עם כלי הדם (למשל, מברשות לשיער יחיד, פיפט מעביר ומלקחיים) בטריפסין על ידי טבילת כלים אלה בתמיסת טריפסין YL לאורך כל ההליך. זה מונע את כלי הדם מלהיצמד למכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. שלישית, מכיוון שהמיקרו-וסקולטורה כמעט בלתי נראית באור רגיל, נדרשת ערנות מוגברת במהלך שאיפת הפסולת והעברתה למגלשת המיקרוסקופ על מנת למנוע אובדן מקרי.
מידה מתאימה של עיכול אנזימטי של השכבות השונות של הרשתית היא חיונית; עיכול לא מספיק מונע את ההפרדה של רקמה עצבית מרשת כלי הדם, בעוד עיכול מוגזם ממיס את מקלעת כלי הדם. דווח על זמני עיכול שונים הנעים בין שעה19 ל-23 בלילה. בהתבסס על תצפיות, זמן עיכול של 4 שעות ו -15 דקות מניב את התוצאות הטובות ביותר בהשוואה למשך שעתיים, 3 שעות ו -4 שעות. הארכת העיכול מעבר לנקודה זו לא צפויה לשפר את התהליך ובמקום זאת עלולה לפגוע בשלמות כלי הדם.
במקרים בהם הרשתית המעוכלת נצמדת למברשת בעלת השערה היחידה, יש לטבול את השיער בתמיסת טריפסין YL מספר פעמים. פעולה זו מפחיתה את האזורים הדביקים של המברשת. אם מברשת השיער עדיין דבקה ברקמת כלי הדם, ואז לבדוק אותו עבור שברים שיורית של זגוגית, ולהסיר אותם עם מלקחיים.
הרגע האופטימלי להסרת זגוגית מלאה הוא לאחר חיסול הפוטורצפטורים, אך לפני הסרת הרקמה העצבית והגלייה הנותרת. הרשתית שומרת על קשיחות עד להסרת פוטורצפטורים. הוצאת הזגוגית בשלב זה עלולה לקרוע את הרשתית/כלי הדם. השכבות העדינות של רקמת הגויה והרקמה העצבית השיורית ממלאות תפקיד מרכזי בשימור הצורה העקומה של מבנה כלי הדם. הם מונעים מהרשתית להיקרע במרכזה כאשר הזגוגית מנותקת מעצבים הראייה.
אם כלי הדם המבודדים אינם נצמדים כלל לשקופית המיקרוסקופ, אז זה מצביע על כך שהחלק בשקופית שבו צפויה להתרחש הדבקה הוא מלוכלך. נסה להזיז את הכלים על פני השטח של המגלשה כדי לאתר נקודה דביקה, לעבור למגלשה אחרת או לנקות את המגלשה בקפידה ולנסות שוב. אם הכלים נדבקים למגלשה לפני שהם נפרשים לצורתם דמוית הקערה, הרימו את כלי הדם מהמגלשה כדי לאפשר לו לצוף שוב בחופשיות במים. בצע שלב זה עם מלקחיים שנטבלו שוב ושוב בתמיסת טריפסין YL.
דווח על מספר טכניקות חלופיות לבידוד כלי הדם, אשר לא יתאימו לבדיקת ההגנה המתוארת כאן. לדוגמה, ליזה אוסמוטית שימשה כדי לבודד את כלי הדם מדגימות רשתית לא קבועות, להקל על חקירות ביוכימיות של הרקמה24,25. עם זאת, הליך זה עשוי שלא לשמר את האנטומיה של כלי הדם, כמו גם את הגישה המיושמת במאמר זה. באופן דומה, בעוד ששיטת הדפסת הרקמה לבידוד מקטעים גדולים של מיקרו-כלי דם מאפשרת ניתוח של הארכיטקטורה האלקטרוטונית של כלי הדם26, מיטת כלי הדם כולה בדרך כלל אינה מתאוששת.
בדיקה זו פותחה מכיוון שהגישות הקיימות לניטור ניוון נימי אינן מתייחסות לנושא ההגנה. ניוון נימי, המתרחש לאחר DM ממושך, מציין אם DR התפתח. בנוסף לאבחון DR, תוצאה זו שימושית כדי להעריך אם סוכן/טיפול מונע DR. עם זאת, בדיקות ניוון נימי קיימות אינן מדברות על מנגנון הפעולה הבסיסי של הסוכן. סוכן כזה עשוי למנוע אירועים פתולוגיים המניעים DR כגון מתח חמצוני מוגבר או ציטוקינים. לחלופין, הסוכן עשוי לאכוף הגנה על ידי שיפור העמידות לעקה חמצונית וציטוקינים ו / או לקדם את תיקון הנזק. ניתן להשתמש בבדיקת הגנה חדשה זו כדי לקבוע אם ההשפעה המיטיבה של טיפול נתון כרוכה באכיפת המערכת האנדוגנית המגנה מפני מוות הקשור ל- DM.
החיסרון של בדיקת הגנה זו הוא שהיא אינה מבחינה בין שני סוגי התאים בתוך כלי הרשתית: תאי אנדותל (ECs) ופריציטים (PC). בעוד שמראה הגרעינים שלהם במקטעים מוכתמים ב-PASH הוא ספציפי לסוג התא (איור 6), לא כל גרעין מציג מאפיינים אבחנתיים. כ-30% מהגרעינים אינם ניתנים להגדרה חד-משמעית כ-EC או PC, לפחות חלקית, משום שהתמונות הדו-ממדיות המתקבלות מדגימות מוכתמות ב-PASH פותרות באופן חלקי את המבנה התלת-ממדי של מקלעת כלי הדם. מכשול זה יכול להתגבר על ידי ניתוח נוסף כגון צביעה immunofluorescent עם סמנים ספציפיים סוג התא. תמונות כאלה, אשר מבדילות בין שני סוגי התאים יכולות להיות מוכתמות יחד עם TUNEL כדי לקבוע את ההתנגדות / פגיעות של כל אחד מסוגי תאי כלי הדם.
בדיקה ממוקדת כלי דם זו אינה מספקת מידע לגבי הרשתית העצבית. ניתן לפתח בדיקות נוספות כדי לספק מידע כזה. לדוגמה, במקום לבודד את כלי הדם ברשתית, ניתן ליצור תרחיף תא בודד של הרשתית כולה ולאחר מכן לנתח אותו (על ידי מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים) להתנגדות/פגיעות. הכללת סמנים ספציפיים לסוג התא (הן עצביים והן וסקולריים) יחד עם אינדיקטורים למוות תאי תספק תמונה מלאה יותר של סוגי תאי הרשתית שיש להם את היכולת להגנה מפני מוות בתיווך DM / DR.
לסיכום, מבחן ההגנה המתואר כאן מספק גישה רבת עוצמה לחקירת המנגנון האחראי לעיכוב בין הופעת DM לבין הופעת DR בעכברים.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאגודה למניעת עיוורון באילינוי, המכון הלאומי לבריאות (EY031350 ו-EY001792) ומענק בלתי מוגבל מקרן המחקר למניעת עיוורון.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved