A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
פרוטוקול מפורט מסופק לניקוי ושימוש חוזר בצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט לביצוע בידוד שלפוחית חוץ-תאי המתאים לניסויים בפרוטאומיקה.
פלסטיק מעבדה חד-פעמי מחריף את משבר הזיהום ותורם לעלויות מתכלות. בבידוד שלפוחית חוץ-תאית (EV), צינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט (UC) משמשים כדי לשאת את הכוחות הצנטריפוגליים הגבוהים הקשורים. פרוטאומיקה של EV היא תחום מתקדם ופרוטוקולים מתוקפים לשימוש חוזר עבור צינורות אלה חסרים. שימוש חוזר בחומרים מתכלים עבור פרוטוקולי בידוד חלבונים בעלי תפוקה נמוכה ופרוטאומיקה במורד הזרם דורש תאימות מגיבים עם רכישות ספקטרוסקופיית מסה, כגון היעדר זיהום פולימר סינתטי שמקורו בצינור צנטריפוגה, והסרה מספקת של חלבונים שיוריים.
פרוטוקול זה מתאר ומאמת שיטה לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט לשימוש חוזר בניסויי פרוטאומיקה של EV. תהליך הניקוי כולל טבילה מיידית של צינורות UC ב- H2O כדי למנוע התייבשות חלבון, שטיפה בחומר ניקוי 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), שטיפה במי ברז חמים, מים נטולי מינרלים ו- 70% אתנול. כדי לאמת את פרוטוקול השימוש החוזר בשפופרת UC עבור פרוטאומיקה של EV במורד הזרם, התקבלו שפופרות משומשות בעקבות ניסוי שבודד כלי רכב חשמליים מרקמת הלב וכלי הדם באמצעות UC דיפרנציאלי והפרדת שיפוע צפיפות. צינורות נוקו והתהליך הניסיוני חזר על עצמו ללא דגימות EV שהשוו שפופרות UC ריקות שמעולם לא נעשה בהן שימוש לצינורות UC מנוקים. כדורי הפסאודו-EV שהתקבלו מהליכי הבידוד עברו ליזה והוכנו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית באמצעות ערכת הכנת דגימת חלבון מסחרית עם שינויים לדגימות חלבון בשפע נמוך.
לאחר הניקוי, מספר החלבונים שזוהו הופחת ב-98% בפסאודו-גלולה לעומת דגימת הבידוד הקודמת של EV מאותה צינור. בהשוואה בין צינורית נקייה לשפופרת ריקה, שתי הדגימות הכילו מספר קטן מאוד של חלבונים (≤20) עם דמיון של 86%. היעדר פסגות פולימריות בכרומטוגרמות של הצינורות המנוקים אושר. בסופו של דבר, תיקוף פרוטוקול ניקוי צינורות UC המתאים להעשרת כלי רכב חשמליים יפחית את הפסולת המיוצרת על ידי מעבדות EV ויוזיל את עלויות הניסוי.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים המופרדים בין שומנים דו-שכבתיים המשתחררים מתאים הנושאים מטען פעיל ביולוגית, כגון חלבון, ומשתתפים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל תקשורת תא-תא והיווצרות מינרליזציה ביולוגית1. חלקיקים אלה נמצאים בכל נוזלי הגוף והרקמות, ופעילותם הביולוגית ושימושיהם הם תחום מחקר מדעי המתפתח במהירות. בידוד ותיקוף של ננו-חלקיקים אלה מציבים אתגרים שונים בשל גודלם הקטן והדמיון הביולוגי שלהם לחלקיקים אחרים, כגון ליפוזומים וצברי חלבונים. ההנחיות האחרונות של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות, מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV2018), הן התקן המוכר למחקר מדעי של EV2.
1. ניקוי צינור
הערה: הליך הבידוד של EV משתמש הן בצינורות UC מפוליקרבונט מכוסים והן בצינורות UC לא מכוסים (מפורט להלן). אותו הליך בוצע עבור צינורות מכוסים ולא מכוסים כאחד. במקרה של צינורות סגורים, חלקי המכסה נוקו בנפרד והורכבו מחדש לאחר הייבוש והאחסון מראש.
כדי לאמת את פרוטוקול הניקוי (איור 1), בוצעו שני ניסויים. ראשית, הפרוטאום של "דגימת הדמה" מהשפופרת המנוקה הושווה לפרוטאום של דגימת הרקמה EV מהשימוש הראשוני של הצינורית כדי לקבוע את הנשיאה של חלבונים מזוהים. כרומטוגרמות מייצגות מראות ירידה בהטרוגניות שיא לאחר ניקוי הצינורות (
כאן אנו מתארים ומאמתים פרוטוקול לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט עבור יישומי העשרה ופרוטאומיקה של EV. הדגמנו הסרה מוצלחת של שאריות חלבון מדגימת שפופרת UC הקודמת בהשוואה לניתוח פסאודו-כדוריות מנוקות מתחת לגבול הזיהוי של פרוטוקול רכישת ספקטרומטריית מסות זה, והראינו את הדמיון הפרוטאומי של שפופר.......
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01HL147095, R01HL141917 ו- R01HL136431, Kowa Company, Ltd., ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מס '101023041 ע"ש מארי סקלודובסקה-קירי (R. Cahalane). איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com. פרוטוקול הניקוי הנוכחי פותח על ידי שינוי פרוטוקול ניקוי צינור מומלץ שהוצג ביום החינוך של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ תאיות 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). תודה רבה לד"ר קתרין האו וד"ר סנאה ראג'ו מרשת הבריאות האוניברסיטאית (אוניברסיטת טורונטו, קנדה) על דגימות רקמת התרדמה המקוריות EV.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
MilliQ water | water | ||
PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved