Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול מפורט מסופק לניקוי ושימוש חוזר בצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט לביצוע בידוד שלפוחית חוץ-תאי המתאים לניסויים בפרוטאומיקה.

Abstract

פלסטיק מעבדה חד-פעמי מחריף את משבר הזיהום ותורם לעלויות מתכלות. בבידוד שלפוחית חוץ-תאית (EV), צינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט (UC) משמשים כדי לשאת את הכוחות הצנטריפוגליים הגבוהים הקשורים. פרוטאומיקה של EV היא תחום מתקדם ופרוטוקולים מתוקפים לשימוש חוזר עבור צינורות אלה חסרים. שימוש חוזר בחומרים מתכלים עבור פרוטוקולי בידוד חלבונים בעלי תפוקה נמוכה ופרוטאומיקה במורד הזרם דורש תאימות מגיבים עם רכישות ספקטרוסקופיית מסה, כגון היעדר זיהום פולימר סינתטי שמקורו בצינור צנטריפוגה, והסרה מספקת של חלבונים שיוריים.

פרוטוקול זה מתאר ומאמת שיטה לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט לשימוש חוזר בניסויי פרוטאומיקה של EV. תהליך הניקוי כולל טבילה מיידית של צינורות UC ב- H2O כדי למנוע התייבשות חלבון, שטיפה בחומר ניקוי 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), שטיפה במי ברז חמים, מים נטולי מינרלים ו- 70% אתנול. כדי לאמת את פרוטוקול השימוש החוזר בשפופרת UC עבור פרוטאומיקה של EV במורד הזרם, התקבלו שפופרות משומשות בעקבות ניסוי שבודד כלי רכב חשמליים מרקמת הלב וכלי הדם באמצעות UC דיפרנציאלי והפרדת שיפוע צפיפות. צינורות נוקו והתהליך הניסיוני חזר על עצמו ללא דגימות EV שהשוו שפופרות UC ריקות שמעולם לא נעשה בהן שימוש לצינורות UC מנוקים. כדורי הפסאודו-EV שהתקבלו מהליכי הבידוד עברו ליזה והוכנו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית באמצעות ערכת הכנת דגימת חלבון מסחרית עם שינויים לדגימות חלבון בשפע נמוך.

לאחר הניקוי, מספר החלבונים שזוהו הופחת ב-98% בפסאודו-גלולה לעומת דגימת הבידוד הקודמת של EV מאותה צינור. בהשוואה בין צינורית נקייה לשפופרת ריקה, שתי הדגימות הכילו מספר קטן מאוד של חלבונים (≤20) עם דמיון של 86%. היעדר פסגות פולימריות בכרומטוגרמות של הצינורות המנוקים אושר. בסופו של דבר, תיקוף פרוטוקול ניקוי צינורות UC המתאים להעשרת כלי רכב חשמליים יפחית את הפסולת המיוצרת על ידי מעבדות EV ויוזיל את עלויות הניסוי.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים המופרדים בין שומנים דו-שכבתיים המשתחררים מתאים הנושאים מטען פעיל ביולוגית, כגון חלבון, ומשתתפים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל תקשורת תא-תא והיווצרות מינרליזציה ביולוגית1. חלקיקים אלה נמצאים בכל נוזלי הגוף והרקמות, ופעילותם הביולוגית ושימושיהם הם תחום מחקר מדעי המתפתח במהירות. בידוד ותיקוף של ננו-חלקיקים אלה מציבים אתגרים שונים בשל גודלם הקטן והדמיון הביולוגי שלהם לחלקיקים אחרים, כגון ליפוזומים וצברי חלבונים. ההנחיות האחרונות של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות, מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV2018), הן התקן המוכר למחקר מדעי של EV2.

Protocol

1. ניקוי צינור

הערה: הליך הבידוד של EV משתמש הן בצינורות UC מפוליקרבונט מכוסים והן בצינורות UC לא מכוסים (מפורט להלן). אותו הליך בוצע עבור צינורות מכוסים ולא מכוסים כאחד. במקרה של צינורות סגורים, חלקי המכסה נוקו בנפרד והורכבו מחדש לאחר הייבוש והאחסון מראש.

  1. לאחר השי?.......

Representative Results

כדי לאמת את פרוטוקול הניקוי (איור 1), בוצעו שני ניסויים. ראשית, הפרוטאום של "דגימת הדמה" מהשפופרת המנוקה הושווה לפרוטאום של דגימת הרקמה EV מהשימוש הראשוני של הצינורית כדי לקבוע את הנשיאה של חלבונים מזוהים. כרומטוגרמות מייצגות מראות ירידה בהטרוגניות שיא לאחר ניקוי הצינורות (

Discussion

כאן אנו מתארים ומאמתים פרוטוקול לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט עבור יישומי העשרה ופרוטאומיקה של EV. הדגמנו הסרה מוצלחת של שאריות חלבון מדגימת שפופרת UC הקודמת בהשוואה לניתוח פסאודו-כדוריות מנוקות מתחת לגבול הזיהוי של פרוטוקול רכישת ספקטרומטריית מסות זה, והראינו את הדמיון הפרוטאומי של שפופר.......

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01HL147095, R01HL141917 ו- R01HL136431, Kowa Company, Ltd., ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מס '101023041 ע"ש מארי סקלודובסקה-קירי (R. Cahalane). איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com. פרוטוקול הניקוי הנוכחי פותח על ידי שינוי פרוטוקול ניקוי צינור מומלץ שהוצג ביום החינוך של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ תאיות 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). תודה רבה לד"ר קתרין האו וד"ר סנאה ראג'ו מרשת הבריאות האוניברסיטאית (אוניברסיטת טורונטו, קנדה) על דגימות רקמת התרדמה המקוריות EV.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate TubeBeckman Coulter Life Sciences355630uncapped ultracentrifuge tube(s) 
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter Life Sciences355603capped ultracentrifuge tube(s) 
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mmThermoFisher Scientific164946 and ES902Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton HeadVWR89031-270cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.  ThermoFisher ScientificBRE725533Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)NANAHuman database
MilliQ waterwater
PreOmics iST kit  PreOmicsP.O.00027commercial protein sample preparation kit 
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)ThermoFisher ScientificNAProteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm NANASearch algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)Boston BioProductsBM-230detergent

References

  1. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Théry, C., et al.

Explore More Articles

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved