שימוש חוזר בצינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט באנליזות פרוטאומיות של שלפוחיות חוץ-תאיות

Summary

פרוטוקול מפורט מסופק לניקוי ושימוש חוזר בצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט לביצוע בידוד שלפוחית חוץ-תאי המתאים לניסויים בפרוטאומיקה.

Abstract

פלסטיק מעבדה חד-פעמי מחריף את משבר הזיהום ותורם לעלויות מתכלות. בבידוד שלפוחית חוץ-תאית (EV), צינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט (UC) משמשים כדי לשאת את הכוחות הצנטריפוגליים הגבוהים הקשורים. פרוטאומיקה של EV היא תחום מתקדם ופרוטוקולים מתוקפים לשימוש חוזר עבור צינורות אלה חסרים. שימוש חוזר בחומרים מתכלים עבור פרוטוקולי בידוד חלבונים בעלי תפוקה נמוכה ופרוטאומיקה במורד הזרם דורש תאימות מגיבים עם רכישות ספקטרוסקופיית מסה, כגון היעדר זיהום פולימר סינתטי שמקורו בצינור צנטריפוגה, והסרה מספקת של חלבונים שיוריים.

פרוטוקול זה מתאר ומאמת שיטה לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט לשימוש חוזר בניסויי פרוטאומיקה של EV. תהליך הניקוי כולל טבילה מיידית של צינורות UC ב- H₂O כדי למנוע התייבשות חלבון, שטיפה בחומר ניקוי 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), שטיפה במי ברז חמים, מים נטולי מינרלים ו- 70% אתנול. כדי לאמת את פרוטוקול השימוש החוזר בשפופרת UC עבור פרוטאומיקה של EV במורד הזרם, התקבלו שפופרות משומשות בעקבות ניסוי שבודד כלי רכב חשמליים מרקמת הלב וכלי הדם באמצעות UC דיפרנציאלי והפרדת שיפוע צפיפות. צינורות נוקו והתהליך הניסיוני חזר על עצמו ללא דגימות EV שהשוו שפופרות UC ריקות שמעולם לא נעשה בהן שימוש לצינורות UC מנוקים. כדורי הפסאודו-EV שהתקבלו מהליכי הבידוד עברו ליזה והוכנו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית באמצעות ערכת הכנת דגימת חלבון מסחרית עם שינויים לדגימות חלבון בשפע נמוך.

לאחר הניקוי, מספר החלבונים שזוהו הופחת ב-98% בפסאודו-גלולה לעומת דגימת הבידוד הקודמת של EV מאותה צינור. בהשוואה בין צינורית נקייה לשפופרת ריקה, שתי הדגימות הכילו מספר קטן מאוד של חלבונים (≤20) עם דמיון של 86%. היעדר פסגות פולימריות בכרומטוגרמות של הצינורות המנוקים אושר. בסופו של דבר, תיקוף פרוטוקול ניקוי צינורות UC המתאים להעשרת כלי רכב חשמליים יפחית את הפסולת המיוצרת על ידי מעבדות EV ויוזיל את עלויות הניסוי.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים המופרדים בין שומנים דו-שכבתיים המשתחררים מתאים הנושאים מטען פעיל ביולוגית, כגון חלבון, ומשתתפים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל תקשורת תא-תא והיווצרות מינרליזציה ביולוגית¹. חלקיקים אלה נמצאים בכל נוזלי הגוף והרקמות, ופעילותם הביולוגית ושימושיהם הם תחום מחקר מדעי המתפתח במהירות. בידוד ותיקוף של ננו-חלקיקים אלה מציבים אתגרים שונים בשל גודלם הקטן והדמיון הביולוגי שלהם לחלקיקים אחרים, כגון ליפוזומים וצברי חלבונים. ההנחיות האחרונות של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות, מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV2018), הן התקן המוכר למחקר מדעי של EV².

Protocol

1. ניקוי צינור

הערה: הליך הבידוד של EV משתמש הן בצינורות UC מפוליקרבונט מכוסים והן בצינורות UC לא מכוסים (מפורט להלן). אותו הליך בוצע עבור צינורות מכוסים ולא מכוסים כאחד. במקרה של צינורות סגורים, חלקי המכסה נוקו בנפרד והורכבו מחדש לאחר הייבוש והאחסון מראש.

1. לאחר השי?.......

Discussion

כאן אנו מתארים ומאמתים פרוטוקול לניקוי שפופרות UC מפוליקרבונט עבור יישומי העשרה ופרוטאומיקה של EV. הדגמנו הסרה מוצלחת של שאריות חלבון מדגימת שפופרת UC הקודמת בהשוואה לניתוח פסאודו-כדוריות מנוקות מתחת לגבול הזיהוי של פרוטוקול רכישת ספקטרומטריית מסות זה, והראינו את הדמיון הפרוטאומי של שפופר.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent