Повторное использование поликарбонатной ультрацентрифужной пробирки в протеомном анализе внеклеточных везикул

Summary

Предоставляется подробный протокол очистки и повторного использования поликарбонатных ультрацентрифужных пробирок для проведения внеклеточной изоляции везикул, подходящей для экспериментов по протеомике.

Abstract

Одноразовый лабораторный пластик усугубляет кризис загрязнения и увеличивает расходы на расходные материалы. При выделении внеклеточных везикул (EV) используются поликарбонатные ультрацентрифужные (UC) трубки, выдерживающие связанные с этим высокие центробежные силы. Протеомика электромобилей является развивающейся областью, и проверенные протоколы повторного использования для этих трубок отсутствуют. Повторное использование расходных материалов для протоколов выделения белков с низким выходом и последующей протеомики требует совместимости реагентов с масс-спектроскопией, например, отсутствия загрязнения синтетическим полимером, полученным из центрифужных пробирок, и достаточного удаления остаточных белков.

Этот протокол описывает и проверяет метод очистки поликарбонатных трубок UC для повторного использования в экспериментах по протеомике EV. Процесс очистки включает в себя немедленное погружение трубок UC в_H2Oдля предотвращения высыхания белка, промывку в моющем средстве с 0,1% додецилсульфатом натрия (SDS), промывку в горячей водопроводной воде, деминерализованной воде и 70% этаноле. Для валидации протокола повторного использования пробирок UC для последующей протеомики EV были получены использованные пробирки после эксперимента по выделению EV из сердечно-сосудистой ткани с использованием дифференциального разделения UC и градиента плотности. Трубки были очищены, и экспериментальный процесс был повторен без образцов EV, сравнивая пустые, никогда не использовавшиеся трубки UC с очищенными трубками UC. Гранулы псевдо-EV, полученные в результате процедур выделения, лизировали и подготавливали для жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии с использованием коммерческого набора для пробоподготовки белков с модификациями для образцов белков с низкой численностью.

После очистки количество идентифицированных белков в псевдогрануле было уменьшено на 98% по сравнению с предыдущим образцом выделения EV из той же пробирки. Сравнивая очищенную пробирку с пустой пробиркой, оба образца содержали очень небольшое количество белков (≤20) со сходством 86%. Подтверждено отсутствие полимерных пиков в хроматограммах очищенных пробирок. В конечном счете, валидация протокола очистки трубок UC, подходящего для обогащения электромобилей, сократит количество отходов, производимых лабораториями электромобилей, и снизит затраты на эксперименты.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой частицы, ограниченные липидами-бислой, высвобождаемые из клеток, которые несут биологически активный груз, такой как белок, и участвуют в различных биологических процессах, включая межклеточную коммуникацию и образование биологической^{минерализации.} Эти частицы содержатся во всех жидкостях и тканях организма, а их биологическая активность и использование являются быстро развивающейся областью научных исследований. Выделение и валидация этих наночастиц сопряжены с различными проблемами из-за их небольшого размера и биосходства с другими частицами, такими как липосомы и белковые агрегаты. Самые последн....

Protocol

1. Чистка трубок

ПРИМЕЧАНИЕ: В процедуре изоляции EV используются как закрытые, так и незакрытые поликарбонатные трубки UC (подробнее ниже). Одна и та же процедура применялась как для закрытых, так и для незакрытых пробирок. В случае закрытых пробирок части крышки оч?.......

Discussion

Здесь мы описываем и проверяем протокол очистки поликарбонатных трубок UC для обогащения электромобилей и протеомных приложений. Мы продемонстрировали успешное удаление остаточного белка из предыдущего образца пробирки с ЯК по сравнению с анализом очищенных псевдогранул ниже предел.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent