A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית
In This Article
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.
Abstract
איתות סידן הוא וסת אינטגרלי של כמעט כל רקמה. בתוך אפיתל המעי, סידן מעורב בוויסות פעילות ההפרשה, דינמיקה של אקטינים, תגובות דלקתיות, התפשטות תאי גזע ותפקודים תאיים רבים אחרים שאינם מאופיינים. ככזה, מיפוי דינמיקת איתות הסידן בתוך אפיתל המעי יכול לספק תובנה לגבי תהליכים תאיים הומיאוסטטיים ולחשוף תגובות ייחודיות לגירויים שונים. אורגנואידי מעיים אנושיים (HIOs) הם מודל בעל תפוקה גבוהה שמקורו בבני אדם לחקר אפיתל המעי ובכך מייצגים מערכת שימושית לחקר דינמיקת הסידן. מאמר זה מתאר פרוטוקול להתמרה יציבה של HIOs עם מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs), ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי וניתוח נתוני הדמיה כדי לאפיין באופן משמעותי אותות סידן. כדוגמה מייצגת, HIOs תלת מימדיים הומרו עם lentivirus כדי לבטא ביציבות GCaMP6s, GECI ציטוסולי ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטי. לאחר מכן פוזרו ה-HIOs המהונדסים לתרחיף חד-תאי ונזרעו כחד-שכבות. לאחר ההתמיינות, חד-שכבות HIO נדבקו בנגיף הרוטה ו/או טופלו בתרופות הידועות כמעוררות תגובת סידן. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בתא הדמיה חי מבוקר טמפרטורה ולח איפשר הדמיה ארוכת טווח של חד-שכבות נגועות או מטופלות בתרופות. לאחר ההדמיה, התמונות שנרכשו נותחו באמצעות תוכנת הניתוח הזמינה באופן חופשי, ImageJ. בסך הכל, עבודה זו מקימה צינור מותאם לאפיון איתות סלולרי ב- HIOs.
Introduction
סידן הוא שליח שני שנשמר באופן נרחב וממלא תפקיד קריטי בוויסות הפיזיולוגיה התאית1. בהתחשב במטען החזק שלו, גודלו הקטן ומסיסותו הגבוהה בתנאים פיזיולוגיים, סידן הוא מניפולטור אידיאלי של קונפורמציה חלבונית. זה הופך את הסידן לאמצעי רב עוצמה להמרת אותות אלקטרוכימיים לשינויים אנזימטיים, שעתוק או לאחר שעתוק. שיפועי ריכוז הסידן המחמירים על פני הרשתית האנדופלסמית (ER) וקרומי הפלזמה יוצרים כוח מניע גבוה המאפשר שינויים מהירים בריכוז הסידן הציטוסולי. מנגנונים מרובים, כולל חציצה והובלה אקטיבית, שומרים בחוזקה על שיפוע זה. בעוד שהוא נחוץ לתפקודים תאיים תקינים, תחזוקה זו יקרה מבחינה אנרגטית, מה שהופך אותו לרגיש במיוחד במצבי לחץ 2.
Protocol
כל אורגנואידי המעי האנושי (HIOs) המשמשים בפרוטוקול זה והניסויים המייצגים נגזרו מרקמה אנושית שהושגה ותוחזקה על ידי המרכז הרפואי טקסס למחלות עיכול Enteroid Core. כל הדגימות נאספו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה.
1. הכנת חומרים וריאגנטים
Representative Results
איור 1A מראה כיפת BMM המכילה אורגנואידים תלת-ממדיים של המעי האנושי שהומרו לביטוי יציב של GCaMP6s. איור 1B מראה את אותו קו של אורגנואיד מצופה מחדש כמו חד-שכבתי ב-24, 48 ו-72 שעות לאחר הזריעה. כדי לאמת את הפונקציה של GCaMP6s, המונושכבה צולמה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 2 ש.......
Discussion
שינויים ברמות Ca2+ ציטוסוליים יכולים להיות סיבה ותוצאה של פתולוגיות בתוך אפיתל 10,16,17. עלייה בסידן ציטוסולי יכולה לגרום ישירות להפרשה באמצעות הפעלת תעלת הכלוריד תלוית הסידן TMEM16A18,19. הפעלת TMEM16A בתגובה ל- C.......
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים R01DK115507 ו R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH). תמיכת המתאמנים ניתנה על ידי מענקי NIH F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) ו- F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). ברצוננו להודות למרכז הרפואי טקסס Digestive Diseases Enteroid Core על אספקת אמצעי תחזוקת האורגנואידים.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved