Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Summary

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Abstract

La segnalazione del calcio è un regolatore integrale di quasi tutti i tessuti. All'interno dell'epitelio intestinale, il calcio è coinvolto nella regolazione dell'attività secretoria, nella dinamica dell'actina, nelle risposte infiammatorie, nella proliferazione delle cellule staminali e in molte altre funzioni cellulari non caratterizzate. Pertanto, la mappatura delle dinamiche di segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale può fornire informazioni sui processi cellulari omeostatici e svelare risposte uniche a vari stimoli. Gli organoidi intestinali umani (HIO) sono un modello ad alto rendimento, derivato dall'uomo, per studiare l'epitelio intestinale e rappresentano quindi un sistema utile per studiare la dinamica del calcio. Questo documento descrive un protocollo per trasdurre stabilmente HIO con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), eseguire microscopia a fluorescenza dal vivo e analizzare i dati di imaging per caratterizzare in modo significativo i segnali di calcio. Come esempio rappresentativo, gli HIO tridimensionali sono stati trasdotti con lentivirus per esprimere stabilmente GCaMP6s, un GECI citosolico basato su proteine fluorescenti verdi. Gli HIO ingegnerizzati sono stati poi dispersi in una sospensione a cellula singola e seminati come monostrati. Dopo la differenziazione, i monostrati HIO sono stati infettati con rotavirus e/o trattati con farmaci noti per stimolare una risposta al calcio. Un microscopio a epifluorescenza dotato di una camera di imaging dal vivo umidificata a temperatura controllata ha consentito l'imaging a lungo termine di monostrati infetti o trattati con farmaci. Dopo l'imaging, le immagini acquisite sono state analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ, disponibile gratuitamente. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una pipeline adattabile per la caratterizzazione della segnalazione cellulare negli HIO.

Introduction

Il calcio è un secondo messaggero ampiamente conservato che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della fisiologia cellulare¹. Data la sua forte carica, le piccole dimensioni e l'elevata solubilità in condizioni fisiologiche, il calcio è un manipolatore ideale della conformazione proteica. Ciò rende il calcio un potente mezzo per trasdurre i segnali elettrochimici in alterazioni enzimatiche, trascrizionali o post-trascrizionali. I rigidi gradienti di concentrazione di calcio attraverso il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane plasmatiche creano un'elevata forza motrice che consente rapidi cambiamenti nella concentrazione citosolic....

Protocol

Tutti gli organoidi intestinali umani (HIO) utilizzati in questo protocollo e negli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da tessuto umano ottenuto e mantenuto dal Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Tutti i campioni sono stati raccolti in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board del Baylor College of Medicine.

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

1. Per il mantenimento degli organoidi, raccogliere pias.......

Discussion

Le alterazioni dei livelli citosolici di Ca²⁺ possono essere sia causa che effetto di patologie all'interno dell'epitelio 10,16,17. L'aumento del calcio citosolico può guidare direttamente la secrezione attraverso l'attivazione del canale del cloro calcio-dipendente TMEM16A^18,19. L'attivazione di TMEM16A in risposta a Ca²⁺ consente l'efflusso apica.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254