Differenziazione delle linee del sistema nervoso enterico dalle cellule staminali pluripotenti umane

Summary

La derivazione di linee del sistema nervoso enterico (ENS) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) fornisce una fonte scalabile di cellule per studiare lo sviluppo e la malattia dell'ENS e per l'uso nella medicina rigenerativa. Qui viene presentato un protocollo dettagliato in vitro per derivare neuroni enterici da hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite.

Abstract

Il sistema nervoso enterico umano, ENS, è una vasta rete di tipi di cellule gliali e neuronali con una notevole diversità di neurotrasmettitori. L'ENS controlla la motilità intestinale, la secrezione enzimatica e l'assorbimento dei nutrienti e interagisce con il sistema immunitario e il microbioma intestinale. Di conseguenza, i difetti dello sviluppo e acquisiti dell'ENS sono responsabili di molte malattie umane e possono contribuire ai sintomi del morbo di Parkinson. Le limitazioni nei sistemi modello animale e l'accesso al tessuto primario pongono sfide sperimentali significative negli studi sull'ENS umano. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per un'efficace derivazione in vitro dei lignaggi ENS da cellule staminali pluripotenti umane, hPSC, utilizzando condizioni di coltura definite. Il nostro protocollo inizia con la differenziazione diretta delle hPSC in cellule della cresta neurale enterica entro 15 giorni e produce diversi sottotipi di neuroni enterici funzionali entro 30 giorni. Questa piattaforma fornisce una risorsa scalabile per studi sullo sviluppo, modellazione di malattie, scoperta di farmaci e applicazioni rigenerative.

Introduction

Il sistema nervoso enterico (ENS) è il componente più grande del sistema nervoso periferico. L'ENS contiene più di 400 milioni di neuroni che si trovano all'interno del tratto gastrointestinale e controllano quasi tutte le funzioni dell'intestino¹. La comprensione molecolare dello sviluppo e della funzione dell'ENS e dei suoi difetti nelle neuropatie enteriche richiede l'accesso a una fonte affidabile e autentica di neuroni enterici. L'accesso al tessuto primario umano è limitato e i modelli animali non riescono a ricapitolare i fenotipi chiave della malattia in molte neuropatie enteriche. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti uman....

Protocol

1. Preparazione dei terreni

NOTA: Le concentrazioni menzionate nel protocollo sono concentrazioni finali dei componenti del fluido. Preparare tutti i terreni in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare e conservarli a 4 °C al buio. Utilizzare entro 2 settimane.

1. Terreno di mantenimento hPSC: Miscelare l'integratore di terreno di mantenimento hPSC senza alimentatore (20 μL/mL) con il suo terreno di base.
2. Terreno A: aggiungere la proteina morfogenet.......

Discussion

Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un robusto metodo in vitro per ottenere neuroni enterici da hPSC entro 30-40 giorni (Figura 1E) e glia enterica che esprimono proteina acida fibrillare gliale, GFAP e SOX10 in colture più vecchie (> giorno 55)13,14,19,22. Questi neuroni e la glia sono indotti dalla differenziazione graduale delle hP.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254