Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas

Summary

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

Abstract

O sistema nervoso entérico humano, ENS, é uma grande rede de tipos de células gliais e neuronais com notável diversidade de neurotransmissores. O ENS controla a motilidade intestinal, a secreção enzimática e a absorção de nutrientes e interage com o sistema imunológico e o microbioma intestinal. Consequentemente, os defeitos de desenvolvimento e adquiridos do SNE são responsáveis por muitas doenças humanas e podem contribuir para os sintomas da doença de Parkinson. Limitações em sistemas de modelos animais e acesso ao tecido primário representam desafios experimentais significativos em estudos do ENS humano. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a derivação in vitro eficaz das linhagens ENS de células-tronco pluripotentes humanas, hPSC, usando condições de cultura definidas. Nosso protocolo começa com a diferenciação direcionada de hPSCs em células da crista neural entérica em 15 dias e produz diversos subtipos de neurônios entéricos funcionais em 30 dias. Essa plataforma fornece um recurso escalável para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e aplicações regenerativas.

Introduction

O sistema nervoso entérico (SNE) é o maior componente do sistema nervoso periférico. O ENS contém mais de 400 milhões de neurônios localizados no trato gastrointestinal e controlam quase todas as funções do intestino¹. A compreensão molecular do desenvolvimento e função do SNE e seus defeitos nas neuropatias entéricas requer acesso a uma fonte confiável e autêntica de neurônios entéricos. O acesso ao tecido primário humano é limitado e os modelos animais não conseguem recapitular os principais fenótipos da doença em muitas neuropatias entéricas. A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) provou ser extremamente benéfica no forn....

Protocol

1. Preparação de mídia

NOTA: As concentrações mencionadas em todo o protocolo são concentrações finais dos componentes do meio. Preparar todos os meios em condições estéreis numa coifa de fluxo laminar e conservar a 4 °C no escuro. Use dentro de 2 semanas.

1. Meio de manutenção hPSC: Misture o suplemento de meio de manutenção hPSC sem alimentador (20 μL / mL) com seu meio base.
2. Meio A: Adicione a proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 1 ng/m.......

Discussion

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método in vitro robusto para obter neurônios entéricos de hPSCs dentro de 30-40 dias (Figura 1E) e glia entérica expressando proteína glial fibrilar ácida, GFAP e SOX10 em culturas mais antigas (> dia 55) ^{13 , 14 , 19 , 22} . Esses neurônios e glia são induzidos pela diferenciação gradual de .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254