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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

Abstract

O sistema nervoso entérico humano, ENS, é uma grande rede de tipos de células gliais e neuronais com notável diversidade de neurotransmissores. O ENS controla a motilidade intestinal, a secreção enzimática e a absorção de nutrientes e interage com o sistema imunológico e o microbioma intestinal. Consequentemente, os defeitos de desenvolvimento e adquiridos do SNE são responsáveis por muitas doenças humanas e podem contribuir para os sintomas da doença de Parkinson. Limitações em sistemas de modelos animais e acesso ao tecido primário representam desafios experimentais significativos em estudos do ENS humano. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a derivação in vitro eficaz das linhagens ENS de células-tronco pluripotentes humanas, hPSC, usando condições de cultura definidas. Nosso protocolo começa com a diferenciação direcionada de hPSCs em células da crista neural entérica em 15 dias e produz diversos subtipos de neurônios entéricos funcionais em 30 dias. Essa plataforma fornece um recurso escalável para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e aplicações regenerativas.

Introduction

O sistema nervoso entérico (SNE) é o maior componente do sistema nervoso periférico. O ENS contém mais de 400 milhões de neurônios localizados no trato gastrointestinal e controlam quase todas as funções do intestino1. A compreensão molecular do desenvolvimento e função do SNE e seus defeitos nas neuropatias entéricas requer acesso a uma fonte confiável e autêntica de neurônios entéricos. O acesso ao tecido primário humano é limitado e os modelos animais não conseguem recapitular os principais fenótipos da doença em muitas neuropatias entéricas. A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) provou ser extremamente benéfica no forn....

Protocol

1. Preparação de mídia

NOTA: As concentrações mencionadas em todo o protocolo são concentrações finais dos componentes do meio. Preparar todos os meios em condições estéreis numa coifa de fluxo laminar e conservar a 4 °C no escuro. Use dentro de 2 semanas.

  1. Meio de manutenção hPSC: Misture o suplemento de meio de manutenção hPSC sem alimentador (20 μL / mL) com seu meio base.
  2. Meio A: Adicione a proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 1 ng/m.......

Representative Results

Este protocolo fornece um método para derivar crista neural entérica e neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas ( Figura 1A-B ). A geração de neurônios de alta qualidade depende de uma etapa eficiente de indução da crista neural entérica. Isso pode ser avaliado visualmente verificando a morfologia das esferas flutuantes que devem parecer redondas com superfícies lisas com um tamanho de aproximadamente 0,1 - 0,4 mm, como vis.......

Discussion

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método in vitro robusto para obter neurônios entéricos de hPSCs dentro de 30-40 dias (Figura 1E) e glia entérica expressando proteína glial fibrilar ácida, GFAP e SOX10 em culturas mais antigas (> dia 55) 13 , 14 , 19 , 22 . Esses neurônios e glia são induzidos pela diferenciação gradual de .......

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

O trabalho foi apoiado por doações do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora e da Fundação Sandler, March of Dimes concessão nº 1-FY18-394 e 1DP2NS116769-01, o Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH (DP2NS116769) para F.F. e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R01DK121169) para F.F., H.M. é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da Fundação Larry L. Hillblom, bolsa NIH T32-DK007418 e bolsa de pós-doutorado independente do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric dis....

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