עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NO.81860413, 81960455), קרן מחלקת המדע והטכנולוגיה של יונאן (202001AY070001-080), קרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2019J1274).

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים לסרטן יונאן/בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג. כל הנבדקים/אפוטרופוסים חתמו על הסכמה מדעת.
1. הכנת שקופיות
<ol><li>חתכו מקטעים של גושי פרפין זוגיים המכילים גידול ריאתי ראשוני או סרטן ריאות במ?...

In Situ Immunohistochemical Detection of Immune Cell Markers in Cancer Tissues

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

תיארנו את התהליך של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מחזורית מרובה. בחירת הנוגדנים הראשונית היא היבט מכריע של בדיקת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית, ונוגדנים חד-שבטיים מומלצים לספציפיות וחזרתיות טובות יותר. כדי לייעל את ריכוז העבודה של הנוגדן הראשוני, סדרה של דילולים נבדקו באמצעות ...

גרורות במוח (BM) מייצגות את הגידולים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתרחשים בכמעט מחצית ממקרי סרטן הריאה של תאים לא קטנים (NSCLC), עם פרוגנוזה גרועה1. על פי הערכות, ל-10%-20% מחולי NSCLC כבר יש BM בזמן האבחנה הראשונית, וכ-40% ממקרי NSCLC יפתחו BM במהלך הטיפול2. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) קשורה קשר הדוק עם התרחשות NSCLC ו-BM, כולל רכיבים שונים, כגון כלי דם, פיברובלסטים, מקרופאגים, מטריצה חוץ-תאית (ECM), לימפואיד, תאים חיסוניים שמקורם במח עצם ומולקולות איתות 3,4. תאי חיסון מיקרו-סביבתיים ממלאים תפקיד מכריע בהשפעה על גדילה והתפתחות של תאים סרטניים. גרורות במוח מציגות מטרות טיפול פוטנציאליות רבות המאופיינות במיקרו-סביבות אימונולוגיות מורכבות ובתהליכי איתות. לדוגמה, מעכבי PD-1 הראו יעילות קלינית עבור חולים עם גרורות במוח של סרטן ריאות (LCBM) כמעכב מחסום חיסוני (ICI). עם זאת, תדירות התגובות לטיפול ב-PD-1 משתנה בין NSCLC ראשוני ל-LCBM5, מה שמרמז על כך שהמיקרו-סביבה החיסונית של הגידול פועלת כמווסת ICI קריטי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא כלי רב ערך בתחומי הביולוגיה, רפואת היסוד והפתולוגיה6. שיטת זיהוי זו ממחישה ביטוי אנטיגן באמצעות אינטראקציה של נוגדן אנטיגן על שקופיתרקמה 7. IHC משמש לאבחון סמנים מנבאים, הערכת סמנים פרוגנוסטיים, הנחיית טיפולים ממוקדים וחקירת התפקודים הביולוגיים של תאי גידול8. עם זאת, שיטת IHC המסורתית יכולה לזהות רק סמן ביולוגי אחד בכל פעם. כדי להתמודד עם מגבלה זו, החדשנות של הטכנולוגיה האימונוהיסטוכימית הובילה לפיתוח אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת משתתפים (mfIHC), המאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים חלבוניים מרובים על אותה שקופית רקמה, הן בשדה בהיר והן בשדה פלואורסצנטי9. התקדמות זו מספקת ניתוח מדויק של הרכב התאים והאינטראקציות המולקולריות בין תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון ותאי סרטן בתוך TME.
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה מחזורית מרובת משתתפים לניתוח ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון. שני נוגדנים ראשוניים ממינים שונים, כגון ארנב וחולדה, נבחרים לדגירת דגירה בו זמנית, ולאחר מכן נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנטיות. שליפת אנטיגן מתבצעת לאחר כל סבב של תגובת אנטיגן-נוגדנים. אוטופלואורסצנטיות חסומה, ו-4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) משמש להכתמת הגרעינים. הפאנל כולל זיהוי רציף של CD3, CD8, CD20 ו- CK, תאים מסווגים לפי הסמנים: תאי גידול (CK+), תאי T בוגרים (CD3+), תאי T ציטוטוקסיים (CD3+CD8+), תאי B (CD20+)10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

המיקרו-סביבה של הגידול כוללת אינטראקציות בין תאים מארחים, תאי גידול, תאי חיסון, תאי סטרומה וכלי דם. אפיון וארגון מרחבי של תת-קבוצות תאי חיסון וחלבוני מטרה חיוניים למטרות פרוגנוסטיות וטיפוליות. זה הוביל לפיתוח של שיטות צביעה immunohistochemistry multiplexed. אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים מרובים, מה שמקל על הבנה מקיפה של תפקוד התא ואינטראקציות בין-תאיות. במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה עבור בדיקת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת מחזורים ויישומה בניתוח הכימות של תת-קבוצות לימפוציטים. צביעת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית המחזורית המרובבת עוקבת אחר שלבים וריאגנטים דומים לאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית, וכוללת שליפת אנטיגן, דגירה מחזורית של נוגדנים וצביעה על שקופית רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין (FFPE). במהלך תגובת האנטיגן-נוגדנים מכינים תערובת של נוגדנים ממינים שונים. תנאים, כגון זמן אחזור אנטיגן וריכוז נוגדנים, ממוטבים ומאומתים כדי להגדיל את יחס האות לרעש. טכניקה זו ניתנת לשחזור ומשמשת כלי רב ערך למחקר אימונותרפיה וליישומים קליניים.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אנטיגן מחזורי באמצעות פלואורסצנטיות מרובת 5 צבעים בשקופית אחת. באמצעות האופטימיזציה שלנו של הבדיקה, אנו מאפשרים דגירה של שני נוגדנים ממינים שונים (איור 1). המכשירים הדרושים להליך הניסוי כוללים סיר לחץ וקופסת צביעה חיסונית (איור 2A)...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry

אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.

אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת משתתפים

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

האתגר עבור אימונוהיסטוכימיה הוא לבחור את המינים של נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים ומשניים כדי למנוע תגובתיות צולבת ולקבל ספציפיות וחזרתיות טובות יותר. החלטה מגדרית נחוצה כדי לייעל את יחס דילול הנוגדנים. בינתיים, אתגר נוסף הוא ליישר את הלוקליזציה של ותתי המבנים.השימוש בפרוטוקול זה עונה על ההתפתחות הטכנית של התפלגות שלוש תת-אוכלוסיות לימפוציטיות, כגון CT שלוש, CT חיובי שלוש, CT שמונה חיובי ו-CT 20 חיובי בהתבסס על ספירת התאים וביטוי החלבונים ברקמות השימור ניתן לראות גם את רמת ההסתננות. בפרוטוקול שלנו, הפרמטר נוגדנים ונוגדנים משניים פלואור נובעים ממינים שונים בתערובת ISO מה שהופך אותנו ליעילים. מדד זה מראה גם מדד ספציפי בין נוגדנים לאנטיגן.