Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex

Summary

A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.

Abstract

O microambiente tumoral envolve interações entre células hospedeiras, células tumorais, células imunes, células estromais e vasculatura. Caracterizar e organizar espacialmente subgrupos de células imunes e proteínas-alvo são cruciais para fins prognósticos e terapêuticos. Isso levou ao desenvolvimento de métodos de coloração imunoistoquímica multiplexada. A imunohistoquímica por fluorescência multiplex permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores, facilitando uma compreensão abrangente da função celular e das interações intercelulares. Neste trabalho, descrevemos um fluxo de trabalho para o ensaio de imunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex e sua aplicação na análise de quantificação de subgrupos de linfócitos. A coloração por imunoistoquímica fluorescente cíclica multiplex segue etapas e reagentes semelhantes aos da imunohistoquímica padrão, envolvendo recuperação de antígenos, incubação cíclica de anticorpos e coloração em lâmina de tecido fixada em formalina e emblocada em parafina (FFPE). Durante a reação antígeno-anticorpo, uma mistura de anticorpos de diferentes espécies é preparada. Condições, como tempo de recuperação de antígenos e concentração de anticorpos, são otimizadas e validadas para aumentar a relação sinal-ruído. Esta técnica é reprodutível e serve como uma ferramenta valiosa para pesquisas em imunoterapia e aplicações clínicas.

Introduction

As metástases cerebrais (MB) representam os tumores mais comuns do sistema nervoso central (SNC), ocorrendo em quase metade dos casos de câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC), com mau prognóstico1^. Estima-se que 10%-20% dos pacientes com CPNPC já apresentam MB no momento do diagnóstico inicial, e aproximadamente 40% dos casos de CPNPC desenvolverão MB durante o curso do tratamento². O microambiente tumoral (TME) está intimamente associado à ocorrência de CPNPC e MB, incluindo vários componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células imunes linfoides, derivadas da medu....

Protocol

A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética médica do Yunnan Cancer Hospital/Third Affiliated Hospital da Kunming Medical University. Todos os sujeitos/responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação do slide

1. Cortes de blocos de parafina pareados contendo células de metástases cerebrais de tumor primário de pulmão ou câncer de pulmão com espessura de 4 μm usando micrótomo. Retire as seções para regar e separe com um.......

Discussion

Descrevemos o processo para coloração imunoistoquímica por fluorescência cíclica multiplex. A seleção primária de anticorpos é um aspecto crucial do ensaio imunohistoquímico de fluorescência, e anticorpos monoclonais são recomendados para melhor especificidade e repetibilidade. Para otimizar a concentração de trabalho do anticorpo primário, uma série de diluições tem sido testada através de experimentos de imunohistoquímica. Tanto os controles positivos (para avaliar a expressão do antígeno alvo) qu.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418