Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

3D-печать в микрометровом масштабе позволяет быстро создавать прототипы полимерных устройств для культур нейрональных клеток. В качестве доказательства принципа структурные связи между нейронами ограничивались созданием барьеров и каналов, влияющих на рост нейритов, в то время как функциональные последствия таких манипуляций наблюдались внеклеточной электрофизиологией.

Abstract

Культуры нейронов были эталонной экспериментальной моделью в течение нескольких десятилетий. Тем не менее, 3D-расположение клеток, пространственные ограничения на рост нейритов и реалистичные синаптические связи отсутствуют. Последнее ограничивает изучение структуры и функции в контексте компартментализации и уменьшает значение культур в нейронауке. Аппроксимация ex vivo структурированного анатомического расположения синаптических связей нетривиальна, несмотря на то, что она является ключом к возникновению ритмов, синаптической пластичности и, в конечном счете, патофизиологии мозга. Здесь двухфотонная полимеризация (2PP) используется в качестве технологии 3D-печати, что позволяет быстро изготавливать полимерные устройства для культивирования клеток с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) в микрометровом масштабе. По сравнению с традиционными методами литья копий, основанными на микрофотолитографии, микромасштабная печать 2PP позволяет быстро и недорого изготавливать прототипы. Этот протокол иллюстрирует проектирование и производство микрофлюидных устройств на основе PDMS, предназначенных для культивирования модульных нейронных сетей. В качестве доказательства принципа представлено двухкамерное устройство для физического ограничения подключения. В частности, асимметричный аксональный нарост во время развития ex vivo является предпочтительным и может быть направлен из одной камеры в другую. Для исследования функциональных последствий однонаправленных синаптических взаимодействий выбираются коммерческие микроэлектродные матрицы для мониторинга биоэлектрической активности взаимосвязанных нейронных модулей. В данной работе проиллюстрированы методы 1) изготовления пресс-форм с микрометрической точностью и 2) выполнения in vitro многосайтовых внеклеточных записей в культурах нейронов коры головного мозга крыс. Благодаря снижению затрат и широкой доступности 3D-печати 2PP этот метод будет становиться все более и более актуальным в исследовательских лабораториях по всему миру. Простота и скорость создания прототипов, упрощенных моделей in vitro , особенно в нейротехнологиях и высокопроизводительной записи нейронных данных, улучшит экспериментальный контроль и теоретическое понимание крупномасштабных нейронных систем in vivo .

Introduction

Исследование активности нейронов в поведении организмов сопряжено с рядом проблем. Например, физический доступ к мозговой ткани ограничен необходимостью поддерживать ее целостность, поэтому поверхностные области мозга легче рассматривать. Изоляция конкретных мишеней в интактной ткани часто является сложной задачей, а иногда и невозможной. Несмотря на то, что диссоциированные однородные культуры нейронов обеспечивают удобный доступ к молекулярным, биохимическим и биофизическим свойствам отдельных (суб)клеточных компонентов нейронной цепи, реалистичная связь и анатомическая организация неповрежденного мозга теряются. Эти фундаментальные ограничения вдохновили исследователей на достижение золотой середины, когда сложность in vivo избегается, в то время как структура может быть построена in vitro, что по требованию 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . В частности, модульные нейронные культуры были предметом обширных исследований в течение последних десятилетий, направленных на решение ключевых вопросов физиологии мозга, как описано ниже.

Организация: Исследования in vivo показывают, что мозг анатомически структурирован слоями с точными типами клеток и массивами проекций. Функциональные анализы выявили организацию нейронных сетей в узловых узлах и модулях, с точными схемами связей10,11. Роль связей и микросхемных мотивов, однако, не может быть изучена адекватно in vivo из-за огромного количества вовлеченных синапсов, а также взаимосвязанных эффектов развития и пластичности, зависящей от активности.

Передача сигнала: В культурах in vivo или случайных in vitro сложно оценить передачу сигнала. Изучение аксональной проводимости и потенциала действия по всей его длине требует направления роста нейрита путем поверхностной функционализации или химического структурирования, обеспечивающего высокое отношение сигнал/шум во внеклеточных считываниях электрической активности12.

Трансляционная актуальность: Расшифровка исключительной роли пре- и постсинаптических элементов при патологических состояниях требует индивидуального доступа к этим элементам. Модульные культуры с ограниченной связностью, эффективно разделяющие пре- и постсинаптические элементы, являются незаменимыми инструментами для достижения этой цели13.

Существует несколько методов получения той или иной формы структуры в культуре нейронов. В широком смысле их можно классифицировать как химические и физические манипуляции с поверхностью9. Первые методы14,15 основаны на склонности нейронных клеток прикрепляться к определенным (био)химическим соединениям. Для этого необходимо нанести адгезивные или привлекательные молекулы на поверхность с точностью до микромасштаба и следовать детальному рисунку. Несмотря на то, что это позволяет частично покрыть поверхность клеток в соответствии с желаемой схемой, химические методы по своей природе ограничены и имеют относительно низкую частоту успеха в руководстве по росту нейритов16. Полный контроль над направленностью аксонов требует установления пространственного градиента специальных химических веществ для формирования аксонального направления17. Последние методы включают в себя манипуляции с физической поверхностью и чаще используются для структурирования нейронных сетей in vitro. Нейронные клетки физически ограничены в желаемых местах геометрическими ограничениями, такими как микроскопические камеры, стенки, каналы и т. д., формируя биосовместимый полимер, такой как полидиметилсилоксан (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, отвержденный и затвердевающий в микрофлюидное устройство. Де-факто методом микрофлюидного изготовления PDMS является мягкая фотолитография21, при которой двумерная маска создается в микромасштабе и используется для селективного травления материала на основе кремния при воздействии ультрафиолета. В двух словах, УФ-отверждаемая смола (т.е. фоторезист) наносится на кремниевую пластину методом центрифугирования, достигая определенной высоты, определяемой ее вязкостью и скоростью вращения. Затем узорчатая маска помещается на фоторезист и подвергается воздействию ультрафиолета. Прозрачные области внутри маски, соответствующие интересующим областям, позволяют ультрафиолетовому излучению индуцировать локализованное сшивание молекул фоторезиста. Участки неэкспонированного фоторезиста смываются с помощью растворителя, в результате чего образуется мастер-форма. Он многократно используется для запекания эластомера по выбору (т.е. PDMS), на который затем наносится гравировка желаемой геометрии в любом количестве копий. Такой способ изготовления является наиболее распространенным методом изготовления микрофлюидных устройств22. Возможно, основными ограничениями мягкой фотолитографии являются предпосылки значительных капиталовложений и незнание биологическими лабораториями необходимых методов и опыта. Подготовка маски и этапы мягкой фотолитографии, необходимые для проектирования сложных геометрий многовысотной геометрии с высоким соотношением сторон, нетривиальны23 и часто требуют аутсорсинга. Несмотря на то, что были предложены альтернативные и малобюджетные методы, они не всегда удовлетворяют высоким требованиям точности биологическогопрототипирования.

Здесь представлен альтернативный метод производства, основанный на двухфотонной полимеризации (2PP) и аддитивном производстве. Он прост и сам по себе не требует продвинутых знаний в области микропроизводства и микрофотолитографии. Область исследований микропроизводства 2PP возникла в конце 90-хгодов25, и с тех пор она переживает экспоненциальный рост26. Подробнее об основных принципах этой методики можно прочитать в другом месте26. Вкратце, фокусируя возбуждающий световой импульс в трехмерном пространстве, 2PP использует нелинейную зависимость многофотонного поглощения от интенсивности. Это обеспечивает возможность ограниченного поглощения, обеспечивая точное и избирательное возбуждение в очень локализованных областях. По сути, фоторезист отрицательного тона, материал с пониженной растворимостью при воздействии света, подвергается сфокусированному пучку фемтосекундных лазерных импульсов с малым скважностью27. Это позволяет получать импульсы высокой интенсивности при низких средних мощностях, обеспечивая полимеризацию без вреда для материала. Взаимодействие фотоиндуцированных радикальных мономеров приводит к образованию радикальных олигомеров, инициирующих полимеризацию, которая распространяется по всему фоторезисту до определенного объема, т. е. воксела, размер которого зависит от интенсивности и длительности лазерных импульсов28.

В данной работе представлены два компонента: А) проектирование и быстрое изготовление 3D-печатной пресс-формы, многократно используемой для получения одноразовых полимерных устройств для культивирования нейрональных клеток (рис. 1), и Б) их механическое сопряжение с поверхностью субстратов планарных нейрональных клеточных культур или даже интегрированных в субстрат микроэлектродных матриц, способных осуществлять многоузловую запись биоэлектрических сигналов.

Автоматизированное проектирование 3D-модели очень кратко описано здесь, а также сопровождается этапами, ведущими к 3D-печатной пресс-форме и изготовлению устройств PDMS.

Для создания исходной 3D-модели объекта и создания файла STL для управления процессом печати 2PP можно использовать различные программные приложения для автоматизированного проектирования. В Таблице материалов первое и последнее перечисленные приложения являются бесплатными или предоставляются со свободной лицензией. Построение 3D-модели всегда требует создания 2D-эскиза, который затем выдавливается на последующих этапах моделирования. Чтобы продемонстрировать эту концепцию, в разделе протокола выделен общий процесс проектирования программного обеспечения 3D CAD, что приводит к структуре, состоящей из перекрывающихся кубов. Для получения более полной информации доступен ряд онлайн-учебников и бесплатных учебных ресурсов, как указано в таблице материалов.

Полученный STL-файл затем преобразуется в серию команд, которые будут выполняться 3D-принтером (т.е. процедура нарезки). Для конкретного используемого 3D-принтера 2PP используется программное обеспечение DeScribe для импорта STL-файла и преобразования его в проприетарный формат General Writing Language (GWL). Успех процесса печати 2PP зависит от различных параметров, в частности, мощности лазера и скорости сканирования, сшивания и расстояния штриховки и нарезки. Выбор этих параметров, наряду с выбором объектива и фоторезиста, зависит от мельчайших особенностей конструкции, а также от предполагаемого применения. Таким образом, оптимизация параметров становится необходимой для удовлетворения требований различных сценариев проектирования и сценариев использования. Для данной работы был рассмотрен рекомендуемый рецепт IP-S 25x ITO Shell (3D MF) в качестве конфигурации параметров печати. В конечном счете, механически стабильная напечатанная деталь печатается с необходимым разрешением, минимизируя при этом время 3D-печати.

Конструкция пресс-формы и связанный с ней STL-файл, демонстрируемый в этой работе, состоит из квадратной рамки для разделения пространства клеточной культуры на два отсека: внешнюю область (т.е. впоследствии называемую Source) и внутреннюю область (т.е. впоследствии называемую Target). Эти два отсека соединены наборами микроканалов, каждый из которых характеризуется остроугольными границами, предназначенными для того, чтобы специфически препятствовать росту нейритов от мишени к источнику, но не наоборот, и, таким образом, способствуют направленной синаптической связи между нейронами, растущими на двух участках.

В более ранних исследованиях использовалась различная геометрия микроканалов, чтобы стимулировать направленный рост нейритов. В качестве примера можно привести треугольные формы18, канальные колючие конструкции19 и сужающиеся каналы20. Здесь использован дизайн с остроугольными барьерами по границам микроканала, характеризующийся также асимметричными входами. Эти микроканалы служат для установления непрерывности между закрытым внутренним отсеком, отсеком Target, и внешней областью, отсеком Source. Воронкообразная форма начальной части микроканалов, со стороны Источника, призвана способствовать образованию аксональных пучков и их росту по кратчайшему, т.е. прямому, пути, соединяющему Источник с Мишенью. Треугольное пространство, реализованное с помощью острых углов, имеет больший объем со стороны цели, чтобы эффективно задерживать поиск нейритами пути, способствуя быстрому выстрелу пучков, исходящих от Источника, и занятию доступного пространства. Выбор длины микроканалов 540 мкм эффективно отфильтровывает обычно более короткие дендритные выросты39. Кроме того, их высота 5 мкм препятствует проникновению клеточных сомат через микроканалы. В целом, эта конфигурация способствовала однонаправленной связи между внешними модулями Source и внутренними Target, и здесь она представлена как доказательство принципа среди множества альтернативных вариантов.

В то время как устройства PDMS, изготовленные с помощью пресс-формы 2PP, могут быть прикреплены к поверхности обычных подложек клеточных культур, таких как стеклянные покровные стекла или чашки Петри, в этой работе использовались коммерчески доступные микроэлектродные решетки, интегрированные в подложку. Не было предпринято никаких усилий для оптимизации 3D-дизайна в соответствии с расположением массива микроэлектродов, и механическое сопряжение было выполнено под контролем стереомикроскопии с целью только позиционирования устройства поперек решетки, оставляя некоторое количество микроэлектродов непокрытыми с обеих сторон, источника и мишени. Это позволяет предварительно оценить функциональные последствия ограниченной связности в культурах нейрональных клеток.

Protocol

Все процедуры, связанные с обращением с животными, осуществлялись в соответствии с европейским и итальянским законодательством (Директива Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 г. [2010/63/EU]; Постановление Правительства Италии от 4 марта 2014 г. No 26) были одобрены Комитетом по уходу за животными при Высшей международной школе исследований Аванцати (Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati) и были официально одобрены Министерством здравоохранения Италии (Auth. No. 22DAB. Н.УВД). Это привело к доступности неразумного материала из эксплантированной ткани мозга крысы, который можно было использовать для экспериментальной проверки метода, представленного в этой работе.

1. 3D изготовление пресс-форм методом двухфотонной полимеризации

  1. Генерация файлов САПР
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги демонстрируют общий рабочий процесс 3D-проектирования с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования (например, SolidWorks). Пример файла проекта STL, описанный в этой работе (рис. 2), доступен в виде дополнительного файла кодирования 1, а также через Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
    1. Запустите настольное приложение программного обеспечения для автоматизированного проектирования. В верхней строке меню выберите Создать.
    2. Из предложенных вариантов выберите "Деталь": 3D-представление отдельного компонента проекта. Нажмите комбинацию клавиш Ctrl + 5 , чтобы установить вид эскиза сверху.
    3. На боковой панели выберите "Эскиз " и выберите "Угловой прямоугольник". Выделите один край прямоугольника, щелкнув по нему. Когда появится панель параметров, установите длину равной 100 единицам.
    4. Повторите шаг 1.1.3 для ребра, перпендикулярного предыдущему: установите его длину равной 50 единицам. Выделите прямоугольник, перетащив по нему, удерживая левую кнопку мыши.
    5. В меню "Добавить отношение " выберите "Исправить", чтобы ограничить связи между линиями.
    6. Выйдите из эскиза и повторите шаги с 1.1.3 по 1.1.5, создав новый (меньший) прямоугольник, перекрывающий предыдущий эскиз.
    7. На боковой панели выберите «Элементы» и выберите «Вытянутая бобышка/основание» (Extruded Boss/Base): установите глубину большого и маленького прямоугольников равной 5 и 10 единицам соответственно.
    8. В меню Файл сохраните деталь в формате STL (т.е. в стандартном языке тесселяции).
  2. Обработка файлов САПР
    1. Перенесите STL-файл на персональный компьютер, оснащенный прикладным программным обеспечением DeScribe.
    2. Запустите Describe и в меню File откройте STL-файл. Появится 3D-представление модели.
    3. В разделе «Ориентация» в меню справа поверните модель, чтобы правильно сориентировать ее в пространстве, и центрируйте ее на плоскости.
    4. Отрегулируйте общее масштабирование, выбрав раздел «Масштабирование » в меню справа.
    5. В раскрывающемся меню вверху выберите рецепт IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Это определяет IP-S в качестве фоторезиста, 25-кратное увеличение объектива, подложку с покрытием из оксида индия-олова (ITO) в качестве печатной подложки, а также печать в оболочке и каркасе в качестве рабочего режима с элементами среднего размера (MF).
    6. Перейдите к мастеру, выбрав и установив для параметра Расстояние нарезки (Slicing Distance ) на 1 мкм и Расстояние штриховки (Hatching Distance ) на 0,5 мкм для оболочки и каркаса.
    7. На этапе вывода мастера импорта в разделе «Разделение» определите размер блока как X = 200 мкм, Y = 200 мкм и Z = 265 мкм, а смещение блока как X = 133 мкм, Y = 133 мкм и Z = 0, гарантируя, что тонкие структуры микроканалов не будут затронуты линиями сшивания.
    8. В качестве режима сканирования используйте по умолчанию: Galvo для плоскости X-Y и Piezo для оси Z.
    9. Нажмите Save и в следующем текстовом меню замените строку var $baseLaserPower = $shellLaserPower на var $baseLaserPower = 75, чтобы уменьшить мощность лазера на самом нижнем слое отпечатка до 75%.
    10. Перенесите файлы GWL, полученные в результате описанных выше действий, на рабочую станцию, предназначенную для 3D-печати 2PP.
  3. 3D-печать и разработка образцов
    1. Запустите прикладное программное обеспечение NanoWrite . После инициализации принтера нажмите Exchange Holder в интерфейсе программного обеспечения, чтобы вставить держатель подложки и установить объектив.
    2. Установите объектив 25x в соответствующее положение на наконечнике. Определите, какая сторона стеклянной подложки покрыта ITO, с помощью электронного мультиметра, настроенного на измерение сопротивлений: показания должны быть низкими, например, 100-300 Ω, но только для стороны с покрытием ITO.
    3. Расположите стеклянную подложку на держателе, ориентируя сторону с покрытием ITO вверх. Используйте скотч, чтобы надежно удерживать его на месте.
    4. Под химическим вытяжным шкафом нанесите каплю фоторезиста IP-S в центр стеклянной подложки.
    5. Вставьте держатель в 3D-принтер каплей смолы лицом к объективу (т.е. вниз).
    6. Через меню «Файл » загрузите файлы GWL. Выберите «Приблизиться к образцу», чтобы переместить объектив ближе к капле смолы.
    7. Выберите Find Interface (Найти интерфейс), чтобы разрешить обнаружение интерфейса печати ITO-photoresist на основе разности показателей преломления двух материалов.
    8. Выберите Начать задание, чтобы запустить печать. По окончании печати нажмите Exchange Holder, чтобы извлечь держатель.
    9. Извлеките держатель и аккуратно снимите подложку с напечатанной деталью. Погрузите стеклянную подложку в ацетат метилового эфира пропиленгликоля (PGMEA) на 20 минут под вытяжным шкафом, чтобы проявить напечатанную деталь.
    10. Извлеките субстрат из PGMEA и погрузите его в изопропанол на 5 минут. Дайте напечатанной детали высохнуть на воздухе под химическим вытяжным шкафом.
  4. Послепечатная обработка и монтаж пресс-формы
    1. Отверждите напечатанную деталь воздействием ультрафиолетового света (т. е. 365-405 нм) с достаточной мощностью в течение 5-20 минут (см. Обсуждение для получения подробной информации о мощности).
    2. Под ламинарным колпаком аккуратно снимите напечатанную деталь со стеклянной подложки. Капните ~2 мкл смолы на дно чашки Петри размером 35 мм x 10 мм.
    3. Осторожно расположите напечатанную деталь над каплей и дайте смоле стечь под деталью. Далее отверждите отпечатанную деталь под воздействием ультрафиолетового света в течение 5 минут.
    4. Накройте чашку Петри крышкой и перенесите в духовку для термического отверждения более чем на 30 минут при температуре 80 °C. Не разогревайте духовку предварительно, чтобы избежать деформации или разрушения печатной детали. После отверждения отпечатанная деталь будет постоянно прикреплена ко дну чашки Петри. Отныне напечатанная и смонтированная деталь будет называться пресс-формой.

2. Изготовление PDMS-устройства из субстратов плесени и клеточных культур

  1. Изготовление PDMS-устройств
    1. Приготовьте 20 мл смеси 10:1 (массовое соотношение) основы иотвердителя неполимеризованного ПДМС. Для каждого прибора, и в зависимости от его требуемой высоты, достаточно 1-2 мл смеси PDMS. Храните излишки неполимеризованного PDMS при температуре -20 °C для последующего использования.
    2. Под ламинарным колпаком тщательно перемешайте смесь в течение 4 мин. По мере того, как смесь равномерно улавливает пузырьки воздуха, она становится непрозрачной.
    3. Перелейте смесь в микропробирку объемом 50 мкл и центрифугируйте ее при 168 x g в течение 5 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси и добиться прозрачного внешнего вида.
    4. Обработайте форму 10 мкл гидрофобизирующего агента (например, Repel-silane ES) и дайте ей отдохнуть в течение 7 минут, обеспечив плавное отделение полимеризованного PDMS от формы в дальнейшем.
    5. Промойте форму 1 раз 70% этиловым спиртом и 2 раза деионизированной (DI) водой. Дайте форме высохнуть на воздухе под ламинарным вытяжным колпаком.
    6. Аккуратно вылейте смесь PDMS на форму, пока не будет достигнута предполагаемая конечная высота устройства. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, наливайте смесь аккуратно и с близкого расстояния к поверхности формы.
    7. Накройте форму крышкой и перенесите ее на 18 минут в предварительно разогретую и стабилизированную при температуре 80 °C духовку для отверждения. Для аппаратов высотой более 5 мм и до 1 см увеличьте время отверждения с 18 до 25 мин.
    8. Под колпаком ламинарного потока аккуратно отсоедините отвержденный блок PDMS от формы и погрузите его в изопропанол не менее чем на 10 минут в стеклянную чашку Петри. Изопропанол устраняет несшитые ПДМС. Всегда держите блок PDMS закрытым.
    9. Обновите дозу изопропанола и под стереомикроскопом осторожно вырежьте офтальмологическим ножом центральную квадратную часть устройства (в данной работе обозначенную как Target area). Затем приступайте к дальнейшей разрезке по краям, чтобы добиться окончательной формы устройства.
    10. Извлеките устройство из изопропанола и погрузите его в этанол на 30 минут, а затем промойте 3 раза стерильной деионизированной водой. С этого момента поддерживайте стерильность.
    11. Под ламинарный колпак перенесите прибор в новую чашку Петри, оставив ее крышку слегка открытой. Дайте ему полностью высохнуть на воздухе.
  2. Монтаж устройства и подготовка субстратов для клеточных культур.
    1. Стерилизовать каждую матрицу микроэлектродов (МЭА), погрузив в 70% этанол на 30 минут, а затем 3 раза промыть стерильной деионизированной водой.
    2. С помощью стерильного тонкого пинцета под ламинарным колпаком и стереомикроскопом установите устройство PDMS на внутреннюю поверхность MEA. Выровняйте одну сторону устройства PDMS по центру внутренней области MEA, используя микроэлектроды, интегрированные в подложку, чтобы осталось мало микроэлектродов как в исходной, так и в целевой областях (см. рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы нет необходимости юстировать микроэлектроды МЭА по микроканалу устройства PDMS. Для достижения плотного прилегания между устройством PDMS и поверхностью MEA может потребоваться легкое нажатие на устройство. Ни в коем случае не прикасайтесь к микроэлектродам кончиком пинцета.
    3. Вставьте МЭА с установленным на нем устройством PDMS в камеру плазменного очистителя, чтобы активировать активацию поверхности с помощью воздушной плазмы. Начните процесс с 4-минутного вакуумного насоса, опорожняющего камеру. Затем слегка приоткройте воздушный клапан, чтобы обеспечить контролируемый стравливание воздуха. Закройте воздушный клапан и включите плазменные индукторы, отрегулировав уровень мощности РЧ от 10 Вт до 18 Вт.
    4. Как только появится светящийся свет, дайте процессу продолжаться в течение 80 секунд. Затем выключите плазменный индуктор, закройте клапан вакуумного насоса и осторожно откройте воздушный клапан. Откройте камеру, чтобы достать МЭА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазменная обработка включает в себя воздействие МЭА в нестерильной среде, поместите каждую МЭА под ультрафиолетовый свет в ламинарный колпак на 30 минут, чтобы обеспечить стерильность.
    5. Добавьте 1 мл 0,1% раствора полиэтиленимина (PEI) в MEA и инкубируйте его при 37 °C в течение ночи. Аспирируйте раствор PEI и промойте стерильной деионизированной водой 5 раз. Добавьте 1 мл питательной среды для клеточных культур в МЭА и инкубируйте ее перед посевом клеток.

3. Культура нейрональных клеток и электрофизиология

  1. Заранее приготовьте среду для вскрытия, раствор для сбраживания и растворы 1-3 (см. табл. 1).
  2. Диссоциированная культура нейрональных клеток.
    1. Осторожно возьмите новорожденного детеныша крысы Wistar в возрасте 0-1 дня за морду и быстро обезглавьте его острыми ножницами.
    2. Снимите кожу с волосистой части головы, сделайте разрез по сагиттальной средней линии черепа с помощью тонких ножниц, а затем создайте коронарный разрез через череп в месте соединения мозжечка.
    3. Извлеките череп, вычерпайте мозг тонким шпателем и перенесите его в холодную (4 °С) среду для вскрытия.
    4. Удаляют подкорковую ткань, гиппокамп и мозговые оболочки. Измельчите ткань на мелкие кусочки (например, 1-2мм3) и переложите их в пробирку объемом 15 мл. Слейте раствор и промойте ткань свежим средством для препарирования, а затем промойте питательной средой.
    5. Слейте среду для сбраживания, затем добавьте 1 мл раствора 1. Выдерживают смесь при температуре 37 °C в течение 5 мин. Выбросьте раствор 1 и промойте ткань свежим средством для препарирования. Затем добавляют 1 мл 2-го раствора и выдерживают смесь 10 мин при температуре 4 °С.
    6. Выбросьте раствор 2 и промойте ткань свежим средством для вскрытия. Затем добавляют 1 мл 3-го раствора. Механически диссоциируют клетки, медленно пипетируя вверх и вниз раствор от 20 до 30 раз. По мере появления однородной мутной смеси диссоциированных клеток увеличьте ее объем до 3 мл, добавив диссекционную среду.
    7. Соберите гранулы клеток, центрифугируя смесь при 100 x g в течение 5 минут. Отсасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретой питательной среды.
    8. Подсчитайте ячейки (т.е. с помощью камеры для подсчета клеток) и соответствующим образом отрегулируйте плотность раствора для засева клеток.
    9. Засейте каждую МЭА 1 мл посевного раствора с номинальной плотностью клеток 1,8 x 106 (~ 6500 клеток/мм2). Инкубируют посеянные МЭА во влажном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2. Каждые 2 дня заменяйте питательную среду свежей (т.е. еженедельно приготовленной).
  3. Внеклеточная электрофизиология
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциированные культуры нейрональных клеток достигают полностью зрелого электрического фенотипа через 2-3 недели in vitro. В следующих разделах описывается протокол внеклеточной стимуляции с использованием коммерческого прикладного программного обеспечения MEA (Experimenter) для электрической стимуляции любой из популяций нейронов, культивируемых в модулях, т.е. в источнике или мишени, с одновременной регистрацией активности обеих популяций в зрелых сетях.
    1. Аккуратно установите один МЭА внутри головного столика многоканального электронного усилителя в сухой инкубатор (37 °C, 5% CO2) и дайте ему разместиться в течение 10 минут. Индивидуальный колпачок PDMS может быть изготовлен отдельно и использоваться в качестве плотной крышки для каждого MEA, чтобы уменьшить испарение воды и сохранить стерильность.
    2. Запустите программу Experimenter. Установите частоту дискретизации 25 кГц и начните сбор данных, нажав кнопку Start DAQ. На панели «Отображение данных» отображаются необработанные следы внеклеточной записи активности для каждого канала.
    3. Отслеживайте спонтанную активность, визуально идентифицируйте и выбирайте 3 пары соседних микроэлектродов, которые активны во время всплесков спонтанных синхронизированных всплесков активности в масштабах всей сети, либо со стороны источника, либо со стороны мишени.
    4. На панели стимулятора программного обеспечения настройте параметры для каждой из пар стимулирующих микроэлектродов в биполярной конфигурации: выберите двухфазный импульсный сигнал и установите пиковые амплитуды ± 800 мВ, а длительность импульса 200 мкс.
    5. Установите регистратор и запись на период от 300 мс до и 1000 мс после стимуляции.
    6. Повторите шаги с 3.3.3 по 3.3.5 для исходной и целевой сторон чередованием в течение необходимого количества повторений.

Representative Results

Здесь рассказывается об изготовлении 2-компартментного полимерного (нейронального) клеточного культиватора, иллюстрирующего использование 2PP 3D-печати для быстрого прототипирования PDMS-устройств. В частности, получено устройство для модульных нейронных сетей с однонаправленной синаптической связью и представлена его функциональная характеристика в терминах многосайтовой внеклеточной электрофизиологии. Вкратце, пресс-форма микрометрового масштаба была реализована с помощью прямой лазерной записи с использованием коммерчески доступного 3D-принтера. В частности, принтер обеспечивает мощность 50 мВт за счет лазерных импульсов с центральной длиной волны 780 нм и длительностью от 80 до 100 фс. В процессе изготовления лазерный луч фокусируется через объектив (25x, NA=0,8) принтера на фоторезист с отрицательным тоном (IP-S) для сканирования объема печати с помощью гальванического сканера для осей X и Y и пьезостола для оси Z. Объем печати был соответствующим образом разделен на блоки 200 мм x 200 мм x 265 мм для реализации пресс-формы с общим размером 6500 мм x 6500 мм x 545 мм и номинальным объемом 12,423 мл. На рисунке 2A представлен 2D-эскиз пресс-формы, подчеркивающий ее размеры и размер элементов, в то время как на рисунке 2B показана фотография готового устройства, установленного на MEA, крупным планом. Пресс-формы, подготовленные так, как описано в предыдущем разделе, были долговечными и могли быть повторно использованы более 50 раз для изготовления устройств PDMS.

Напечатанная пресс-форма была использована для отливки устройства PDMS, которое затем было установлено на внутренней поверхности интегрированных матриц микроэлектродов (МЭА) со стеклянной подложкой, которые должны были использоваться для многосайтовой внеклеточной регистрации электрической активности нейронов и в качестве доказательства принципа. Для мониторинга активности модульных культур в ответ на пространственно локализованные электрические стимулы, доставляемые внеклеточным подмножеством микроэлектродов, расположенных в каждом культуральном компартменте, использовались коммерческие МЭА, интегрированные в субстрат. Каждый МЭА содержит 120 микроэлектродов из нитрата титана (TiN) диаметром 30 мкм и межэлектродным шагом 100 мкм. На рисунке 2C-D показано размещение PDMS-устройства в верхней части MEA. Геометрические особенности отдельных микроканалов устройства вместе с общей площадью камеры, показанной на рисунке 2C, приводят к компартментализации культивируемых нейронов. Их можно отличить по отсеку, к которому они принадлежат, во внешней области (источник) устройства или во внутренней области (цель) устройства. Предпочтительное аксональное наведение, ограниченное от источника к мишени, диктуется остроугольными краями микроканалов. На рисунке 2D показано размещение полимерного устройства на МЭА и относительная площадь покрытия регистрирующих электродов, расположенных в отсеках Source или Target. Обратите внимание, что точное выравнивание внутренней части микроканалов устройства по отношению к одному или нескольким рядам микроэлектродов МЭА не требовалось для нашего исследования и не проводилось в нашем исследовании.

Репрезентативные доказательства асимметричного роста нейритов представлены на рисунке 3 во время развития ex vivo, показывающем флуоресцентно меченные нейриты при живой визуализации через 6 дней (рис. 3A) и 2 дня после нанесения клеточного покрытия (рис. 3B-D). В то время как нейриты на целевой стороне устройства сталкивались с остроугольными барьерами как препятствиями, препятствующими их продвижению в пространстве, нейриты, происходящие со стороны источника, росли непрерывно и пересекали каналы. Эта асимметрия благоприятствует однонаправленной аксональной связи между нейронами в двух компартментах, проецируемой от источника к мишени, как и предполагалось в дизайне. Этот результат также подтверждается (функциональной) электрофизиологической оценкой электрических реакций, вызванных стимулами, поочередно доставляемыми в каждом из двух компартментов.

Через 3-4 недели in vitro, когда нейронные сети достигли полной зрелости29,30, функциональная связь между двумя компартментами могла быть исследована путем предоставления кратковременных электрических стимулов и мониторинга нейронных реакций, которые онивызывали. Затем двухфазные электрические импульсы с амплитудой 800 мВ поочередно прикладывались только к источнику или только к целевым популяциям (N повторений = 150, N модульных культур = 6), доставляемые 3 парами плоских микроэлектродов в биполярной конфигурации и с чередованием. Таким образом, 3 пары электродов могут быть расположены в области источника МЭА или в целевой области МЭА. Электрические реакции, вызванные каждым стимулом, могут быть затем обнаружены всеми микроэлектродами МЭА после задержки распространения. Записи выполнялись с частотой дискретизации 25 кГц/канал, а полученные внеклеточные необработанные электрические сигналы оцифровывались с разрешением аналого-цифрового преобразования 16 бит. Алгоритм обнаружения пиков32 при пересечении порога был использован в автономном режиме для определения времени возникновения потенциалов внеклеточного действия без выполнения какой-либо сортировки по спайкам. На рисунке 4А-В отчетливо видна сильная асимметрия вызванных реакций, повторяющихся 150 раз в зависимости от места доставки стимула, что свидетельствует о значительном функциональном влиянии геометрических ограничений на предпочтительную направленность связности. На самом деле, при стимуляции со стороны Источника, частота возбуждения популяции нейронов Источника - оцененная путем вычисления гистограммы времени пика перистимульного периода - увеличилась, как и ожидалось, генерируя полный сетевой всплеск потенциалов действия 33,31,34, а затем, после задержки, последовало увеличение частоты возбуждения целевой популяции. Однако, по мере того, как стимуляция доставлялась в целевой популяции, только скорость стрельбы целевой популяции увеличивалась, в то время как популяция источника оставалась в основном молчаливой. На рисунке 4C-D повторяется та же парадигма стимул/реакция в контрольной культуре, без присутствия полимерного устройства (т.е. неструктурированной культуры нейронов), внеклеточные стимулы также доставлялись в течение 4 повторений. В таких контрольных условиях не возникало асимметрии в реакциях, вызываемых любым стимулом. В то время как подмножество микроэлектродов MEA, используемых для доставки стимулов, совпадало с тем, которое используется в модульных сетях, расположение доставки стимула приводило к аналогичной вызванной реакции со стороны всей популяции. Это подтверждает, что устройство PDMS предпочитает однонаправленную синаптическую связь между двумя отсеками. В целом, асимметричные ответы, вызванные в модульных культурах (N = 6), и симметричные ответы, вызванные в контрольных культурах (N = 4), убедительно указывают на ограниченную анатомическую связность компартментализированной системы in vitro. Электрофизиологические данные и сценарии, использованные для создания рисунка 4, доступны через Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

figure-representative results-7874
Рисунок 1: Эскиз изготовления микропресс-формы 2PP и литья реплики PDMS. (A) 3D-модель проектируется в САПР и экспортируется в файл формата Standard Tessellation Language (STL), (B) инструктируется о ее 2-фотонной 3D-печати с помощью лазерно-индуцированной полимеризации в капле смолы (IP-S). (C) Полученная структура используется в качестве пресс-формы для многократного изготовления реплик PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-representative results-8678
Рисунок 2: Пример собственного экспресс-прототипирования устройства PDMS на основе полимерных (нейрональных) клеточных культур. (A) Менее чем за 24 часа микромасштабное аддитивное производство позволяет перейти от CAD-модели к 3D-печатной мастер-модели, которая может быть использована немедленно и многократно в качестве реплики пресс-формы с биосовместимыми эластомерами, такими как PDMS. (В-В) Полученные PDMS-устройства соединены с планарным субстратом для культуры нейрональных клеток, представленным здесь массивом микроэлектродов. Для конкретного дизайна образца в (A) определены две камеры: одна называется Source и обозначается буквой S, а другая называется Target и обозначается буквой T. (D) Нейроны, покрытые в каждой камере, могут выращивать свои нейриты только через серию микроканалов. При правильном выравнивании под контролем стереомикроскопии на рисунке (С) два набора микроэлектродов, интегрированных в субстрат, остаются открытыми, чтобы можно было стимулировать и регистрировать биоэлектрическую активность близлежащих нейронов, расположенных в обоих отсеках. Заметим, что выравнивание микроэлектродов в пределах отдельных микроканалов не было приоритетом этого доказательства принципа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-representative results-10326
Рисунок 3: Визуализация в реальном времени непроницаемых для клеток флуоресцентных репортерных молекул идентифицирует нейриты, удлиненные нейронами, через несколько дней после нанесения клеточного покрытия. (А-Д) Репрезентативные конфокальные флуоресцентные микрофотографии модульных культур нейронов устройства, изготовленные по рисункам 1 и 2 (N = 4, 128 отдельных микроканалов), были получены через 2 и 6 дней после нанесения покрытий клеток. (Б-Д) 40-кратное увеличение и перевернутая шкала серого микрофотографий для лучшей видимости. Окончания микроканалов из отсеков «Источник» и «Мишень» обозначаются буквами S и T соответственно. На рисунке (А) показано широкоугольное изображение культуры, на котором Источник (т.е. внутренняя квадратная область) и Мишень (т.е. внешняя область) заполнены клетками, через 6 дней после нанесения покрытия. (B) и (C) отображают в более ранний момент времени, через 2 дня после нанесения покрытия, рост нейритов на исходной и целевой сторонах микроканалов, соответственно. Маленькие черные треугольники указывают на репрезентативные примеры предполагаемых окончаний пучков аксонов, которые, по-видимому, происходят только от Источника. Стреловидные границы микроканалов указывают на удлинение нейритов по краю (В), где их прохождение непрерывно и направлено в сторону Мишени. В противоположном направлении, рядом с концом Мишени микроканала (С), нейриты, исходящие из Мишени и продвигающиеся на сторону Источника, захватываются на острых углах. (D) далее раскрывает детали вырастания нейрита внутри микроканала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-representative results-12429
Рисунок 4: Функциональная характеристика электрических реакций нейронов с устройством PDMS и без него. МЭА использовались в качестве субстратов для культивирования клеток и использовались для измерения спайковых реакций в масштабах всей сети, вызванных очень коротким (т.е. 200 мкс, 0,8 В) импульсом двухфазной электрической стимуляции, доставленным в биполярной конфигурации. В случае с устройством PDMS, показанным на рисунке 2, нейронные спайковые реакции, зарегистрированные от источника (красный) и от мишени (синий), различаются в зависимости от того, куда доставляется стимул. Предполагаемые аксональные, синаптические и интеграционные задержки становятся очевидными в (А), но не в (В), что указывает на существование предпочтительной синаптической связи (т.е. от источника к мишени). (К-Д) В контрольных условиях (т.е. без устройства PDMS) вызванные ответы, обнаруженные на двух различных наборах микроэлектродов МЭА, не зависят от места доставки стимула. Бледная штриховка, обволакивающая линии на графиках, обозначает мгновенную стандартную ошибку среднего значения (N стимулов = 150). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Имя решенияСостав
полиэтиленимин (PEI) 0,1%1 мл исходного раствора PEI, 9 мл стерильной деионизированной (DI) воды.
Питательная среда (50 мл)Минимальная эссенциальная среда (MEM), дополненная 20 мкМ глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 50 мкМ L-глютамина и 10% термоинактивированной лошадиной сыворотки.
Среда для диссекции (1000 мл)Сбалансированные соли Хэнкса 9,52 г, бикарбонат натрия 350 мг, HEPES 2,83 г, D-(+)-глюкоза 6 г, кинуреновая кислота (конечная концентрация 200 мкМ), D-AP5 (конечная концентрация 25 мкМ), гентамицин 250 мкл, бычий сывороточный альбумин 300 мг, сульфат магния 1,44 г. Отрегулируйте pH до 7,3, защищайте от света и храните при температуре 4°C.
Питательная среда (100 мл)Натрия хлорид 800 мг, Калия хлорид 37 мг, ди-Натрия гидрофосфат 99 мг, HEPES 600 мг, Натрия бикарбонат 35 мг, Кинуреновая кислота, 200 мкл (от 100 мМ материала), D-AP5 100 мкл (от запаса 25 мМ). Отрегулируйте pH до 7,4, защищайте от света и храните при температуре 4 °C.
Решение 1Трипсин 5 мг, дезоксирибонуклеаза I 1,5 мг, в 2 мл среды для пищеварения.
Решение 2Ингибитор трипсина 5 мг, в 5 мл диссекционной среды.
Решение 3Дезоксирибонуклеаза I 1,5 г в 2,5 мл диссекционной среды.

Таблица 1: Таблица решений. Описания продуктов см. в таблице материалов.

Дополнительный файл кодирования 1: Проектный файл STL соответствует структуре, изображенной на рисунке 2A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Несмотря на то, что технология 2PP была применена несколько десятилетий назад, ее применение в микрометровом масштабе для литья реплик на основе PDMS является недавней разработкой43,44. В этом контексте ниже обсуждается ряд моментов, которые помогут пользователям эффективно воспроизвести эту работу.

При проектировании 3D-модели убедитесь, что в ней нет отверстий или самопересечений. При сохранении в формате STL отдавайте предпочтение двоичному формату файла из-за меньшего размера файла, чем в кодировке ASCII. Это особенно полезно для конструкций со сложной геометрией и для объектов миллилитровой ширины. Использование двоичных файлов STL также подразумевает низкую нагрузку на процессор на более поздних этапах процесса подготовки механической части к 3D-печати. Физические размеры объектов в STL-файле представлены в безразмерных единицах. При постобработке STL-файла единицы измерения интерпретируются как микрометры. Поэтому при подготовке файла рекомендуется заранее выбрать интересующую вас единицу, т.е. микрометр. Точность напечатанной модели определяется числом поверхностей, аппроксимирующих мозаичные треугольники. При недостаточном количестве поверхностей возникнет нежелательная шероховатость поверхности. Тем не менее, стремление к чрезмерно высокой точности для очень большого количества поверхностей обходится высокой вычислительной нагрузкой, что приводит к медленной обработке файлов.

Для 3D-печати во время печати 3D-физический объект формируется с помощью быстрого гальвосканирования в плоскости x-y и пьезодвижения в направлении z. Это фокусирует фемтосекундный лазерный луч в пределах любого заданного 3D-воксела. Однако, когда печатные структуры превышают диапазоны пространственного покрытия гальво и пьезо, объект должен быть программно разделен на блоки. Несмотря на то, что это требование к напечатанным деталям миллиметрового размера, стыки между блоками связаны с (несовершенными) линиями сшивания. Тщательная оптимизация количества блоков и размещения линий сшивания в направлениях x, y и z имеет решающее значение для того, чтобы избежать нарушения критических геометрических характеристик конечного объекта линиями сшивания. Пузырьки могут образовываться на границе печати по разным причинам (например, загрязнения и неоднородности фоторезиста подложки) и негативно влиять на качество и целостность печатной структуры. Более того, более высокая мощность лазера может привести к увеличению их возникновения. Снижение мощности лазера на самом нижнем слое печатаемой детали минимизирует вероятность образования пузырьков. В качестве альтернативы печати всей детали в виде твердой конструкции можно рассмотреть метод оболочки и каркаса. Он предполагает печать только внешней поверхности детали (оболочки), а также треугольных призменных элементов внутри нее. Эти элементы разделены горизонтальными слоями (каркасами), удерживающими неполимеризованную смолу в небольших карманах. Этот метод значительно сокращает время печати, что особенно актуально для конструкций миллиметрового размера. Однако, поскольку неполимеризованная смола остается, послепечатное воздействие ультрафиолета необходимо для обеспечения полной механической стабильности, хотя этот шаг должен выполняться аккуратно, чтобы избежать деформации напечатанной детали. Время последующего отверждения зависит от выбранной смолы, толщины детали и мощности УФ-излучения40. Для достижения оптимальных результатов рекомендуется провести первоначальное испытание для оценки времени, необходимого для полного отверждения, используя каплю фоторезиста и оценив его срез после воздействия ультрафиолета. Обычное время отверждения составляет от 5 до 20 минут.

При формовании реплик PDMS чистое изготовление устройства PDMS с характеристиками микрометрового масштаба, без помещений для чистых помещений, может быть сложной задачей: переносимые по воздуху микрочастицы могут находиться на поверхности PDMS с высокой адгезией и препятствовать уплотнению между устройством и подложкой или блокировать сечение отдельных микроканалов. Выполнение этапов протокола под ламинарным колпаком и последовательное экранирование поверхности PDMS изопропанолом существенно минимизирует риск загрязнения. Температура отверждения и его продолжительность напрямую влияют на сшивку PDMS и результирующие физические свойства. В частности, адгезивность отвержденных ПДМС является критическим фактором. С одной стороны, требуется плотное прилегание между устройством PDMS и поверхностью, используемой для культивирования нейрональных клеток (например, стеклянным покровным стеклом или МЭА), чтобы эффективно ограничить прохождение нейритов. С другой стороны, устройство PDMS должно крепиться к поверхности обратимо, чтобы деликатный изоляционный слой MEA не был поврежден после снятия устройства. В то время как усадка PDMS во время отверждения происходит и может быть скорректирована путем предварительного изменения масштаба формы, для указанных здесь температур и интервалов отверждения усадка составит менее 2%42 и не окажет существенного влияния на однослойные устройства PDMS. В целом, для достижения наилучших результатов точно соблюдайте рекомендуемые значения температуры и продолжительности отверждения.

Обзор преимуществ и ограничений метода
Предложена методика на основе 2-фотонной прямой лазерной записи для быстрого изготовления микромасштабных полимерных устройств для экспериментального исследования модульных нейронных сетей. В отличие от мягкой фотолитографии, предлагаемый подход не требует высокого уровня технических знаний при условии доступности и работоспособности функциональной установки для 3D-печати 2PP. Примечательно, что этот метод позволяет перейти от 3D-модели, разработанной в САПР, к функциональному PDMS-устройству в течение одного дня, обеспечивая тем самым прямой и эффективный путь от концепции до реальной реализации. В частности, выбор режима печати на оболочке и строительных лесах значительно сокращает время, необходимое для создания пресс-формы, поскольку печатается только часть ее объема. Последующее УФ-отверждение печатной детали гарантирует ее механическую стабильность и прочность, что подтверждается более чем 50 циклами литья с помощью PDMS.

По сравнению с традиционными методами, 3D-печать 2PP может похвастаться явным преимуществом, которое наиболее ярко проявляется, когда речь идет об изготовлении пресс-форм со значительным соотношением сторон, высокими требованиями к разрешению и сложной трехмерной геометрией. Производство мастер-форм с использованием стандартной УФ-литографии ограничено толщиной резиста около 200 мкм. Для достижения большего соотношения высот и аспектов требуются сложные последовательности циклов35 центрифугирования и экспонирования, дорогостоящие процессы LIGA (литография, гальваника и формование) или глубокое реактивное ионное травление (DRIE)36 . В противоположность этому, как было продемонстрировано в новаторской работе Kumi et al. в 2010 г.37, технология 2PP предлагает практически неограниченные возможности для соотношения сторон печатных деталей, простирающегося от субмикрометра до миллиметра. В данном случае был проиллюстрирован процесс микроизготовления пресс-формы со значительной разницей в высоте ее частей, характеризующийся более чем 100-кратным различием между высотой микроканалов (5 мкм) и максимальной высотой пресс-формы (545 мкм; см. рис. 2).

Кроме того, субмикронное разрешение может быть легко достигнуто за счет следования спецификациям протокола. Для сравнения, достижение улучшенного разрешения пресс-формы с помощью УФ-фотолитографии требует капиталовложений. Маски с высочайшим разрешением, использующие осаждение хрома на кварц с номинальным разрешением 600 нм, стоят на несколько порядков дороже, чем накладные прозрачные маски, напечатанные лазером, которые имеют разрешение 250мкм35, однако см. работу Pirlo et al.41. Чтобы быть жизнеспособным для внутреннего использования, выбранный метод должен быть экономически эффективным. Для многих биологических лабораторий общие расходы, связанные с обычной мягкой фотолитографией или прямым лазерным письмом, представляют собой препятствие. Несмотря на то, что обе технологии можно сделать более доступными, закупив и собрав необходимые компоненты, такой подход требует дополнительных знаний и значительных инвестиций. В этом контексте важным моментом, который следует учитывать, является более широкий спектр применений, достижимых с помощью прямой лазерной записи. В отличие от обычной мягкой фотолитографии, которая в основном ограничивается микропроизводством пресс-форм, 3D-печать 2PP демонстрирует замечательную универсальность. Его потенциальные области применения простираются от микрофлюидики и микрооптики до интегрированной фотоники и микромеханики. Это делает инвестиции в эту технологию привлекательными в качестве общего средства для многочисленных и разнообразных научных областей. Например, методология на основе 2PP, разработанная в этом протоколе, является результатом междисциплинарного сотрудничества между отделениями нейробиологии и математики в нашем учреждении. Кроме того, разработка фоторезиста является активной областью исследований и потенциально может расширить спектр применения 3D-печати 2PP. В качестве примера можно привести недавнее внедрение смолы IP-PDMS. Полимеризуясь в структуры с такими свойствами, как PDMS38, эта смола раскрывает потенциал для прямого микропроизводства биосовместимых компонентов, которые имеют изогнутую поверхность или содержат пустоты. Эти сложности являются препятствием для достижения аналогичных результатов с помощью обычных процедур литья реплик.

В качестве демонстрации этого метода были представлены данные, свидетельствующие о развитии однонаправленной связи между двумя модулями в модульной нейронной сети. Микромасштабная пресс-форма, изготовленная по технологии 2PP, обладала достаточной выносливостью, чтобы подвергнуться многократному литью PDMS, и имеет требуемую точность микромасштабирования. В заключение следует отметить, что сфера применения протокола, описанного в данной работе, выходит за рамки проиллюстрированного случая. По мере того, как доступ к технологии печати 2PP становится все более распространенным, первоначальные инвестиции, необходимые для ее внедрения, будут уменьшаться, в то время как спектр ее потенциальных применений будет расширяться.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

М.Г. выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Рамочной программы Европейского Союза H2020 через Европейский совет по инновациям (проект IN-FET, GA n. 862882, проект Arbor-IO, FLAG-ERA и проект «Мозг человека», ID 650003) и SISSA (Область неврологии). G.N. выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Министерства университетов и исследований Италии (MUR) в виде гранта Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Математическая область). Мы благодарим М. Гиганте, Б. Пасторе и М. Грандольфо за их помощь в 3D-печати, культивировании клеток и визуализации в реальном времени, а также докторов. Массобрио,. Хеппенстолла, Л. Баллерини, Ди Клементе и Х.К. Шультхайса за обсуждение. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolSigma-Aldrich650447
BB cure compact polymerizerPCube SrlWavelengths 365-405 nm, Power 120W
BioMed Amber Resin 1 LformlabsResin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9418
CAD application software SolidWorksDassault Systèmes SolidWorks Corporation, USFusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US).
                                 --------------------------------------
Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Trainings: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
D-AP5Tocris#0106
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichD5025
DeScribeNanoscribe GmbH & Co. KG
di-Sodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich106585
GentamicinThermo Fisher15710049
Hanks′ Balanced SaltsSigma-AldrichH2387
HEPESSigma-AldrichH7523
Horse SerumSigma-AldrichH1138
in vitro MEA recording system MEA2000 miniMultichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
IP-S PhotoresistNanoscribe GmbH & Co. KG
Kynurenic acidSigma-AldrichK3375
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030081
Magnesium sulfateSigma-AldrichM2643
MEA recording application software (Experimenter)Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
Minimum Essential MediumSigma-Aldrich51412C
NanoWriteNanoscribe GmbH & Co. KG
ophthalmic stab Knife 15°HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printerNanoscribe GmbH & Co. KGSN617
Plasma CleanerHARRICK PLASMA
Poly(ethyleneimine) solutionSigma-AldrichP3143
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA)Sigma-Aldrich484431
Repel-silane ESSigma-AldrichGE17133201
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLLNanoscribe GmbH & Co. KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr)Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, GermanyTiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm
SYLGARD 184 KitDow Corning
TrypsinSigma-AldrichT1005
Trypsin inhibitorSigma-AldrichT9003
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles CIMAMOTORI

References

  1. Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
  2. Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
  3. Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
  4. DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
  5. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
  6. Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
  7. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
  8. Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
  9. Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
  10. Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
  11. Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
  12. Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
  13. Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
  14. Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  15. Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
  16. Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
  17. Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
  18. Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
  19. le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
  20. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  21. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  22. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
  23. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
  24. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
  25. Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
  26. Baldacchini, T. . Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , (2015).
  27. Madou, M. J. . Fundamentals of Microfabrication. , (2018).
  28. Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
  29. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  30. Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
  31. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
  32. Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
  33. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
  34. Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
  35. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  36. Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
  37. Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
  38. Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
  39. Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  40. Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
  41. Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
  42. Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
  43. Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
  44. Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

208

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved