使用活细胞成像测量病理蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

Summary

在这里，我们展示了如何将原代海马啮齿动物神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白质诱导对轴突运输的影响，并确定介导这些影响的机制途径。

Abstract

货物沿轴突的双向运输对于维持功能性突触、神经连接和健康神经元至关重要。在多种神经退行性疾病中，轴突运输被破坏，投射神经元特别脆弱，因为需要长距离运输细胞材料并维持大量的轴突质量。几种疾病相关蛋白的病理修饰对转运产生负面影响，包括 tau、淀粉样蛋白β、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶和亨廷顿蛋白，为病理蛋白在疾病中发挥毒性提供了潜在的常见机制。研究这些毒性机制的方法对于了解神经退行性疾病和确定潜在的治疗干预措施是必要的。

在这里，培养的原代啮齿动物海马神经元与多个质粒共转染，以使用荧光标记货物蛋白的活细胞共聚焦成像研究病理蛋白对快速轴突运输的影响。我们从啮齿动物的原代海马神经元的收获、解离和培养开始。然后，我们用质粒 DNA 构建体共转染神经元，以表达荧光标记的货物蛋白和野生型或突变型 tau（用作病理蛋白的示例）。使用结合神经束蛋白细胞外结构域（一种轴突初始段蛋白）的抗体在活细胞中鉴定轴突，并对感兴趣的轴突区域进行成像以测量荧光货物运输。

使用免费提供的 ImageJ 宏 KymoAnalyzer，我们广泛表征了轴突运输的速度、暂停频率和定向货物密度，所有这些都可能受到病理蛋白存在的影响。通过这种方法，我们确定了与病理性 tau 蛋白表达相关的货物暂停频率增加的表型。此外，可以将基因沉默 shRNA 构建体添加到转染混合物中，以测试其他蛋白质在介导转运中断中的作用。该方案很容易与其他神经退行性疾病相关蛋白一起使用，并且是研究这些蛋白质如何破坏轴突运输机制的可重复方法。

Introduction

神经元依靠沿轴突的双向运输来维持功能性突触和神经连接。轴突转运缺陷被认为是多种神经退行性疾病发病机制的关键因素，包括阿尔茨海默病 （AD） 和其他 tau 蛋白病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病 ^1,2,3。事实上，几种疾病相关蛋白的病理修饰会对转运产生负面影响^{（4 中}已论述）。开发方法来研究病理蛋白在疾病中发挥毒性的机制对于了解神经退行性疾病和确定治疗干预的潜在靶点是必要的。

使用分离的鱿鱼轴质模型 ^4,5 对轴突运输的几个重要见解，包括发现常规驱动蛋白、调节运动蛋白的激酶和磷酸酶依赖性途径以及病理蛋白破坏轴突运输调节的机制。鱿鱼轴质与病理形式的 tau 蛋白灌注会抑制顺行快速轴突转运 （FAT），这种作用取决于 tau 磷酸酶激活结构域的暴露，从而激活蛋白磷酸酶 1 （PP1）^6,7,8

Protocol

这些协议得到了密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案已成功应用于 C57BL/6J 背景下的 Tau Knockout 小鼠和野生型 Sprague Dawley 大鼠。其他菌株也应该是可以接受的。

1. 原代海马神经元采集

1. 在硼酸盐缓冲液（12.5 mM 硼酸钠十水合物和 50 mM 硼酸）中涂覆过滤的 0.5 mg/mL 聚-d-赖氨酸 （PDL） 包被 4 孔玻璃底腔室载玻片。?.......

Discussion

越来越多的证据表明，与各种神经退行性疾病相关的多种病理蛋白会破坏神经元的快速轴突运输。这代表了这些疾病中神经毒性的潜在常见机制。为了更好地了解这些蛋白质破坏运输的过程，我们需要能够解决特定问题的工具和模型。此处描述的方法允许检查病理蛋白参与的机制，这些机制会对啮齿动物的原代海马神经元的货物运输产生负面影响。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427