Brug af levende cellebilleddannelse til at måle virkningerne af patologiske proteiner på aksonal transport i primære hippocampus-neuroner

Summary

Her demonstrerer vi, hvordan man kombinerer transfektion af primære hippocampus-gnaverneuroner med levende celle konfokal billeddannelse for at analysere patologiske proteininducerede virkninger på aksonal transport og identificere mekanistiske veje, der medierer disse virkninger.

Abstract

Tovejstransport af last langs axonen er afgørende for at opretholde funktionelle synapser, neural forbindelse og sunde neuroner. Aksonal transport forstyrres i flere neurodegenerative sygdomme, og projektionsneuroner er særligt sårbare på grund af behovet for at transportere cellulære materialer over lange afstande og opretholde betydelig aksonal masse. Patologiske modifikationer af flere sygdomsrelaterede proteiner påvirker transporten negativt, herunder tau, amyloid-β, α-synuclein, superoxiddismutase og huntingtin, hvilket giver en potentiel fælles mekanisme, hvormed patologiske proteiner udøver toksicitet ved sygdom. Metoder til at studere disse toksiske mekanismer er nødvendige for at forstå neurodegenerative lidelser og identificere potentielle terapeutiske interventioner.

Her er dyrkede primære gnaverhippocampus-neuroner co-transfekteret med flere plasmider for at studere virkningerne af patologiske proteiner på hurtig aksonal transport ved hjælp af levende celle konfokal billeddannelse af fluorescerende mærkede lastproteiner. Vi begynder med høst, dissociation og dyrkning af primære hippocampus-neuroner fra gnavere. Derefter co-transfekterer vi neuronerne med plasmid-DNA-konstruktioner for at udtrykke fluorescerende mærket cargoprotein og vildtype eller mutant tau (brugt som et eksempel på patologiske proteiner). Axoner identificeres i levende celler ved hjælp af et antistof, der binder et ekstracellulært domæne af neurofascin, et axon initialt segmentprotein, og et aksonalt område af interesse afbildes for at måle fluorescerende godstransport.

Ved hjælp af KymoAnalyzer, en frit tilgængelig ImageJ-makro, karakteriserer vi i vid udstrækning hastigheden, pausefrekvensen og retningsbestemte lasttætheden af aksonal transport, som alle kan påvirkes af tilstedeværelsen af patologiske proteiner. Gennem denne metode identificerer vi en fænotype med øget lastpausefrekvens forbundet med ekspressionen af patologisk tau-protein. Derudover kan genhæmnings-shRNA-konstruktioner tilføjes til transfektionsblandingen for at teste andre proteiners rolle i formidling af transportforstyrrelser. Denne protokol kan let tilpasses til brug sammen med andre neurodegenerative sygdomsrelaterede proteiner og er en reproducerbar metode til at studere mekanismerne for, hvordan disse proteiner forstyrrer aksonal transport.

Introduction

Neuroner er afhængige af tovejstransport af last langs axonen for at opretholde funktionelle synapser og neural forbindelse. Aksonale transportunderskud menes at være kritiske bidragydere til patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD) og andre tauopatier, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og Huntingtons sygdom ^1,2,3. Faktisk påvirker patologiske modifikationer af flere sygdomsrelaterede proteiner transporten negativt (gennemgået i ⁴). Udvikling af metoder til at under....

Protocol

Disse protokoller blev godkendt af Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Denne protokol er med succes blevet anvendt på Tau Knockout-mus i C57BL/6J-baggrunden og vildtype Sprague Dawley-rotter. Andre stammer bør også være acceptable.

1. Primær hippocampus neuronhøst

1. En 4-brønds glasbundkammer med filtreret 0,5 mg/ml poly-d-lysin (PDL) belægges i boratbuffer (12,5 mM natriumboratdecahydrat og 5.......

Discussion

Der er voksende beviser for, at flere patologiske proteiner forbundet med en række neurodegenerative lidelser forstyrrer hurtig aksonal transport i neuroner. Dette repræsenterer en potentiel fælles mekanisme for neurotoksicitet på tværs af disse sygdomme. For bedre at forstå den proces, hvormed disse proteiner forstyrrer transporten, har vi brug for værktøjer og modeller, der giver os mulighed for at besvare specifikke spørgsmål. Den her beskrevne metode gør det muligt at unde.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427