Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Summary

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Abstract

Bidirectioneel transport van ladingen langs het axon is van cruciaal belang voor het behoud van functionele synapsen, neurale connectiviteit en gezonde neuronen. Axonaal transport wordt verstoord bij meerdere neurodegeneratieve ziekten, en projectieneuronen zijn bijzonder kwetsbaar vanwege de noodzaak om cellulair materiaal over lange afstanden te transporteren en een aanzienlijke axonale massa te behouden. Pathologische modificaties van verschillende ziektegerelateerde eiwitten hebben een negatieve invloed op het transport, waaronder tau, amyloïde-β, α-synucleïne, superoxide dismutase en huntingtine, en bieden een potentieel gemeenschappelijk mechanisme waardoor pathologische eiwitten toxiciteit uitoefenen bij ziekte. Methoden om deze toxische mechanismen te bestuderen zijn nodig om neurodegeneratieve aandoeningen te begrijpen en mogelijke therapeutische interventies te identificeren.

Hier worden gekweekte primaire hippocampusneuronen van knaagdieren samen met meerdere plasmiden om de effecten van pathologische eiwitten op snel axonaal transport te bestuderen met behulp van confocale beeldvorming van fluorescerend gelabelde vrachteiwitten. We beginnen met het oogsten, dissociëren en kweken van primaire hippocampusneuronen van knaagdieren. Vervolgens co-transfecteren we de neuronen met plasmide-DNA-constructen om fluorescerend gelabeld vrachteiwit en wildtype of mutant tau (gebruikt als voorbeeld van pathologische eiwitten) tot expressie te brengen. Axonen worden geïdentificeerd in levende cellen met behulp van een antilichaam dat een extracellulair domein van neurofascine, een eiwit uit het eerste segment van axonen, bindt, en een axonaal interessegebied wordt afgebeeld om fluorescerend vrachtvervoer te meten.

Met behulp van KymoAnalyzer, een vrij verkrijgbare ImageJ-macro, karakteriseren we uitgebreid de snelheid, pauzefrequentie en directionele vrachtdichtheid van axonaal transport, die allemaal kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van pathologische eiwitten. Via deze methode identificeren we een fenotype van verhoogde ladingspauzefrequentie geassocieerd met de expressie van pathologisch tau-eiwit. Daarnaast kunnen gen-uitschakeling shRNA constructen aan de transfectiemix worden toegevoegd om de rol van andere eiwitten te testen bij het mediëren van transportverstoring. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen voor gebruik met andere neurodegeneratieve ziektegerelateerde eiwitten en is een reproduceerbare methode om de mechanismen te bestuderen van hoe die eiwitten axonaal transport verstoren.

Introduction

Neuronen zijn afhankelijk van het bidirectionele transport van vracht langs het axon om functionele synapsen en neurale connectiviteit te behouden. Axonale transporttekorten worden verondersteld een cruciale bijdrage te leveren aan de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en andere tauopathieën, de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Huntington ^1,2,3. Pathologische modificaties van verschillende ziektegerelateerde eiwitten hebben inderdaad een negati....

Protocol

Deze protocollen zijn goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Dit protocol is met succes toegepast op Tau Knockout-muizen met een C57BL/6J-achtergrond en wildtype Sprague Dawley-ratten. Andere soorten zouden ook acceptabel moeten zijn.

1. Oogst van primaire hippocampusneuronen

1. Smeer een glaasje met 4 putjes in met gefilterd 0,5 mg/ml poly-d-lysine (PDL) in boraatbuffer (12,5 mM natri.......

Discussion

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat meerdere pathologische eiwitten die geassocieerd zijn met een verscheidenheid aan neurodegeneratieve aandoeningen het snelle axonale transport in neuronen verstoren. Dit vertegenwoordigt een mogelijk gemeenschappelijk mechanisme van neurotoxiciteit bij deze ziekten. Om beter te begrijpen hoe deze eiwitten het transport verstoren, hebben we tools en modellen nodig waarmee we specifieke vragen kunnen beantwoorden. De hier beschreven methode maakt het mo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427