Bruke levende celleavbildning for å måle effekten av patologiske proteiner på aksonal transport i primære hippocampus-nevroner

Summary

Her demonstrerer vi hvordan man kan kombinere transfeksjon av primære hippocampus gnagernevroner med levende celle konfokal avbildning for å analysere patologiske proteininduserte effekter på aksonal transport og identifisere mekanistiske veier som medierer disse effektene.

Abstract

Toveis transport av last langs aksonet er avgjørende for å opprettholde funksjonelle synapser, nevrale forbindelser og sunne nevroner. Aksonal transport er forstyrret ved flere nevrodegenerative sykdommer, og projeksjonsnevroner er spesielt sårbare på grunn av behovet for å transportere cellulære materialer over lange avstander og opprettholde betydelig aksonal masse. Patologiske modifikasjoner av flere sykdomsrelaterte proteiner påvirker transporten negativt, inkludert tau, amyloid-β, α-synuklein, superoksiddismutase og huntingtin, noe som gir en potensiell felles mekanisme der patologiske proteiner utøver toksisitet ved sykdom. Metoder for å studere disse toksiske mekanismene er nødvendige for å forstå nevrodegenerative lidelser og identifisere potensielle terapeutiske intervensjoner.

Her blir dyrkede primære gnagerhippocampus-nevroner co-transfektert med flere plasmider for å studere effekten av patologiske proteiner på rask aksonal transport ved bruk av levende celle konfokal avbildning av fluorescerende merkede lasteproteiner. Vi begynner med høsting, dissosiasjon og dyrking av primære hippocampus-nevroner fra gnagere. Deretter samtransfekterer vi nevronene med plasmid-DNA-konstruksjoner for å uttrykke fluorescerende merket lasteprotein og villtype eller mutant tau (brukt som et eksempel på patologiske proteiner). Aksoner identifiseres i levende celler ved hjelp av et antistoff som binder et ekstracellulært domene av nevrofascin, et aksoninitialt segmentprotein, og en aksonal region av interesse avbildes for å måle fluorescerende lastetransport.

Ved å bruke KymoAnalyzer, en fritt tilgjengelig ImageJ-makro, karakteriserer vi grundig hastigheten, pausefrekvensen og retningsbestemte lasttettheten til aksonal transport, som alle kan påvirkes av tilstedeværelsen av patologiske proteiner. Gjennom denne metoden identifiserer vi en fenotype med økt lastepausefrekvens assosiert med ekspresjon av patologisk tau-protein. I tillegg kan gen-deaktivering av shRNA-konstruksjoner legges til transfeksjonsblandingen for å teste rollen til andre proteiner i å formidle transportforstyrrelser. Denne protokollen er lett å tilpasse for bruk med andre nevrodegenerative sykdomsrelaterte proteiner og er en reproduserbar metode for å studere mekanismene for hvordan disse proteinene forstyrrer aksonal transport.

Introduction

Nevroner er avhengige av toveis transport av last langs aksonet for å opprettholde funksjonelle synapser og nevrale tilkoblinger. Aksonale transportunderskudd antas å være kritiske bidragsytere til patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD) og andre tauopatier, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og Huntingtons sykdom ^1,2,3. Faktisk påvirker patologiske modifikasjoner av flere sykdomsrelaterte proteiner transporten negativt (gjennomgått i ⁴). Å utvikle metoder for å u....

Protocol

Disse protokollene ble godkjent av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Denne protokollen har blitt brukt på Tau Knockout-mus i C57BL/6J-bakgrunnen og villtype Sprague Dawley-rotter. Andre stammer bør også være akseptable.

1. Primær hippocampus nevronhøsting

1. Belegg et 4-brønns glassbunnkammer med filtrert 0,5 mg/ml poly-d-lysin (PDL) i boratbuffer (12,5 mM natriumboratdekahydrat og 50 mM borsy.......

Discussion

Det er økende bevis på at flere patologiske proteiner assosiert med en rekke nevrodegenerative lidelser forstyrrer rask aksonal transport i nevroner. Dette representerer en potensiell felles mekanisme for nevrotoksisitet på tvers av disse sykdommene. For bedre å forstå prosessen der disse proteinene forstyrrer transport, trenger vi verktøy og modeller som lar oss ta opp spesifikke spørsmål. Metoden beskrevet her tillater undersøkelse av mekanismer engasjert av patologiske protei.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427