Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Summary

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Abstract

O transporte bidirecional de cargas ao longo do axônio é fundamental para manter sinapses funcionais, conectividade neural e neurônios saudáveis. O transporte axonal é interrompido em várias doenças neurodegenerativas, e os neurônios de projeção são particularmente vulneráveis devido à necessidade de transportar materiais celulares por longas distâncias e sustentar massa axonal substancial. Modificações patológicas de várias proteínas relacionadas à doença afetam negativamente o transporte, incluindo tau, β amilóide, α-sinucleína, superóxido dismutase e huntingtina, fornecendo um potencial mecanismo comum pelo qual as proteínas patológicas exercem toxicidade na doença. Métodos para estudar esses mecanismos tóxicos são necessários para entender os distúrbios neurodegenerativos e identificar possíveis intervenções terapêuticas.

Aqui, neurônios primários do hipocampo de roedores cultivados são co-transfectados com vários plasmídeos para estudar os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal rápido usando imagens confocais de células vivas de proteínas de carga marcadas com fluorescência. Começamos com a colheita, dissociação e cultura de neurônios primários do hipocampo de roedores. Em seguida, co-transfectamos os neurônios com construções de DNA de plasmídeo para expressar proteína de carga marcada com fluorescência e tau selvagem ou mutante (usada como exemplo de proteínas patológicas). Os axônios são identificados em células vivas usando um anticorpo que se liga a um domínio extracelular de neurofascina, uma proteína do segmento inicial do axônio e uma região axonal de interesse é fotografada para medir o transporte de carga fluorescente.

Usando o KymoAnalyzer, uma macro ImageJ disponível gratuitamente, caracterizamos extensivamente a velocidade, a frequência de pausa e a densidade de carga direcional do transporte axonal, todos os quais podem ser afetados pela presença de proteínas patológicas. Por meio desse método, identificamos um fenótipo de aumento da frequência de pausa de carga associado à expressão da proteína tau patológica. Além disso, construções de shRNA silenciadoras de genes podem ser adicionadas à mistura de transfecção para testar o papel de outras proteínas na mediação da interrupção do transporte. Este protocolo é facilmente adaptável para uso com outras proteínas relacionadas a doenças neurodegenerativas e é um método reprodutível para estudar os mecanismos de como essas proteínas interrompem o transporte axonal.

Introduction

Os neurônios dependem do transporte bidirecional de carga ao longo do axônio para manter as sinapses funcionais e a conectividade neural. Acredita-se que os déficits de transporte axonal sejam contribuintes críticos para a patogênese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (DA) e outras tauopatias, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington ^1,2,3. De fato, modificações patológicas em várias proteínas relacionadas à doença afetam negativamente o transporte (revisado em

Protocol

Esses protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Michigan State University. Este protocolo foi aplicado com sucesso a camundongos Tau Knockout no fundo C57BL / 6J e ratos Sprague Dawley do tipo selvagem. Outras cepas também devem ser aceitáveis.

1. Colheita primária de neurônios do hipocampo

1. Cubra uma lâmina de câmara de fundo de vidro de 4 poços com poli-d-lisina (PDL) filtrada a 0,5.......

Discussion

Há evidências crescentes de que várias proteínas patológicas associadas a uma variedade de distúrbios neurodegenerativos interrompem o transporte axonal rápido nos neurônios. Isso representa um potencial mecanismo comum de neurotoxicidade nessas doenças. Para entender melhor o processo pelo qual essas proteínas interrompem o transporte, precisamos de ferramentas e modelos que nos permitam abordar questões específicas. O método descrito aqui permite o exame de mecanismos envo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427