Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Summary

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Abstract

El transporte bidireccional de cargas a lo largo del axón es fundamental para mantener las sinapsis funcionales, la conectividad neuronal y las neuronas sanas. El transporte axonal se interrumpe en múltiples enfermedades neurodegenerativas, y las neuronas de proyección son particularmente vulnerables debido a la necesidad de transportar materiales celulares a largas distancias y mantener una masa axonal sustancial. Las modificaciones patológicas de varias proteínas relacionadas con la enfermedad afectan negativamente al transporte, como la tau, la β amiloide, la α-sinucleína, la superóxido dismutasa y la huntingtina, lo que proporciona un posible mecanismo común por el cual las proteínas patológicas ejercen toxicidad en la enfermedad. Los métodos para estudiar estos mecanismos tóxicos son necesarios para comprender los trastornos neurodegenerativos e identificar posibles intervenciones terapéuticas.

Aquí, las neuronas del hipocampo de roedores primarios cultivadas se transfectan conjuntamente con múltiples plásmidos para estudiar los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal rápido utilizando imágenes confocales de células vivas de proteínas de carga marcadas con fluorescencia. Comenzamos con la recolección, disociación y cultivo de neuronas primarias del hipocampo de roedores. A continuación, co-transfectamos las neuronas con construcciones de ADN plasmídico para expresar la proteína de carga marcada con fluorescencia y la tau de tipo salvaje o mutante (utilizada como ejemplo de proteínas patológicas). Los axones se identifican en células vivas utilizando un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de neurofascina, una proteína del segmento inicial del axón, y se obtienen imágenes de una región axonal de interés para medir el transporte de carga fluorescente.

Utilizando KymoAnalyzer, una macro ImageJ disponible gratuitamente, caracterizamos ampliamente la velocidad, la frecuencia de pausa y la densidad de carga direccional del transporte axonal, todo lo cual puede verse afectado por la presencia de proteínas patológicas. A través de este método, identificamos un fenotipo de aumento de la frecuencia de pausa de carga asociado con la expresión de la proteína tau patológica. Además, se pueden agregar construcciones de shRNA silenciadoras de genes a la mezcla de transfección para probar el papel de otras proteínas en la mediación de la interrupción del transporte. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otras proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas y es un método reproducible para estudiar los mecanismos de cómo esas proteínas interrumpen el transporte axonal.

Introduction

Las neuronas dependen del transporte bidireccional de carga a lo largo del axón para mantener las sinapsis funcionales y la conectividad neuronal. Se cree que los déficits de transporte axonal contribuyen de manera crítica a la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras tauopatías, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Huntington ^1,2,3. De hecho, las modificaciones patológicas de varias proteínas relacionadas con la enfermedad afectan negativam....

Protocol

Estos protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. Este protocolo se ha aplicado con éxito a ratones Tau Knockout en el fondo C57BL/6J y a ratas Sprague Dawley de tipo salvaje. Otras cepas también deberían ser aceptables.

1. Recolección primaria de neuronas del hipocampo

1. Cubra un portaobjetos de 4 pocillos con cámara de fondo de vidrio con 0,5 mg/mL .......

Discussion

Cada vez hay más pruebas de que múltiples proteínas patológicas asociadas a una variedad de trastornos neurodegenerativos interrumpen el transporte axonal rápido en las neuronas. Esto representa un posible mecanismo común de neurotoxicidad en estas enfermedades. Para comprender mejor el proceso por el cual estas proteínas interrumpen el transporte, necesitamos herramientas y modelos que nos permitan abordar preguntas específicas. El método descrito aquí permite examinar los mec.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427