Användning av avbildning av levande celler för att mäta effekterna av patologiska proteiner på axonal transport i primära hippocampusneuroner

Summary

Här demonstrerar vi hur man kombinerar transfektion av primära hippocampusgnagarneuroner med konfokalavbildning av levande celler för att analysera patologiska proteininducerade effekter på axonal transport och identifiera mekanistiska vägar som medierar dessa effekter.

Abstract

Dubbelriktad transport av last längs axonen är avgörande för att upprätthålla funktionella synapser, neurala förbindelser och friska neuroner. Axonal transport störs vid flera neurodegenerativa sjukdomar, och projektionsneuroner är särskilt sårbara på grund av behovet av att transportera cellulära material över långa sträckor och upprätthålla betydande axonal massa. Patologiska modifieringar av flera sjukdomsrelaterade proteiner påverkar transporten negativt, inklusive tau, amyloid-β, α-synuklein, superoxiddismutas och huntingtin, vilket ger en potentiell gemensam mekanism genom vilken patologiska proteiner utövar toxicitet vid sjukdom. Metoder för att studera dessa toxiska mekanismer är nödvändiga för att förstå neurodegenerativa sjukdomar och identifiera potentiella terapeutiska interventioner.

Här samtransfekteras odlade hippocampusneuroner från primärgnagare med flera plasmider för att studera effekterna av patologiska proteiner på snabb axonal transport med hjälp av konfokal avbildning av levande celler av fluorescerande märkta lastproteiner. Vi börjar med skörd, dissociation och odling av primära hippocampusneuroner från gnagare. Sedan co-transfekterar vi neuronerna med plasmid-DNA-konstruktioner för att uttrycka fluorescerande märkt lastprotein och vildtyp eller mutant tau (används som ett exempel på patologiska proteiner). Axoner identifieras i levande celler med hjälp av en antikropp som binder en extracellulär domän av neurofascin, ett axoninitialt segmentprotein, och ett axonalt område av intresse avbildas för att mäta fluorescerande lasttransport.

Med hjälp av KymoAnalyzer, ett fritt tillgängligt ImageJ-makro, karakteriserar vi i stor utsträckning hastigheten, pausfrekvensen och den riktade lastdensiteten för axonal transport, som alla kan påverkas av närvaron av patologiska proteiner. Genom denna metod identifierar vi en fenotyp av ökad frekvens av lastpauser som är förknippad med uttrycket av patologiskt tau-protein. Dessutom kan gentystande shRNA-konstruktioner läggas till i transfektionsmixen för att testa andra proteiners roll i att förmedla transportstörningar. Detta protokoll är lätt att anpassa för användning med andra neurodegenerativa sjukdomsrelaterade proteiner och är en reproducerbar metod för att studera mekanismerna för hur dessa proteiner stör axonal transport.

Introduction

Neuroner är beroende av den dubbelriktade transporten av last längs axonen för att upprätthålla funktionella synapser och neural anslutning. Axonala transportbrister tros vara kritiska bidragande orsaker till patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD) och andra tauopatier, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros och Huntingtons sjukdom ^1,2,3. Faktum är att patologiska förändringar av flera sjukdomsrelaterade proteiner påverkar transporten negativt (granskad i ⁴). Att utve....

Protocol

Dessa protokoll godkändes av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på Tau Knockout-möss i C57BL/6J-bakgrundsråttorna och vildtypsråttorna Sprague Dawley. Andra stammar bör också vara acceptabla.

1. Primär skörd av hippocampus neuron

1. Belägg ett 4-håls bottenkammarglas med filtrerad 0,5 mg/ml poly-d-lysin (PDL) i boratbuffert (12,5 mM natriumbora.......

Discussion

Det finns växande bevis för att flera patologiska proteiner associerade med en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar stör snabb axonal transport i neuroner. Detta representerar en potentiell gemensam mekanism för neurotoxicitet i dessa sjukdomar. För att bättre förstå hur dessa proteiner stör transporten behöver vi verktyg och modeller som gör det möjligt för oss att ta itu med specifika frågor. Metoden som beskrivs här gör det möjligt att undersöka mekanismer som ä.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427