Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Summary

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Abstract

Yüklerin akson boyunca çift yönlü taşınması, fonksiyonel sinapsları, nöral bağlantıyı ve sağlıklı nöronları korumak için kritik öneme sahiptir. Aksonal taşıma, çoklu nörodejeneratif hastalıklarda bozulur ve projeksiyon nöronları, hücresel materyalleri uzun mesafeler boyunca taşıma ve önemli aksonal kütleyi sürdürme ihtiyacı nedeniyle özellikle savunmasızdır. Tau, amiloid-β, α-sinüklein, süperoksit dismutaz ve huntingtin dahil olmak üzere hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerin patolojik modifikasyonları, patolojik proteinlerin hastalıkta toksisite uyguladığı potansiyel bir ortak mekanizma sağlayarak transportu olumsuz etkiler. Bu toksik mekanizmaları inceleme yöntemleri, nörodejeneratif bozuklukları anlamak ve potansiyel terapötik müdahaleleri belirlemek için gereklidir.

Burada, kültürlenmiş primer kemirgen hipokampal nöronları, floresan etiketli kargo proteinlerinin canlı hücre konfokal görüntülemesini kullanarak patolojik proteinlerin hızlı aksonal taşıma üzerindeki etkilerini incelemek için çoklu plazmitlerle birlikte transfekte edilir. Kemirgenlerden birincil hipokampal nöronların toplanması, ayrıştırılması ve kültürlenmesi ile başlıyoruz. Daha sonra, floresan etiketli kargo proteinini ve vahşi tip veya mutant tau'yu (patolojik proteinlerin bir örneği olarak kullanılır) eksprese etmek için nöronları plazmit DNA yapılarıyla birlikte transfekte ederiz. Aksonlar, canlı hücrelerde, hücre dışı bir nörofasin alanını, bir akson başlangıç segmenti proteinini bağlayan bir antikor kullanılarak tanımlanır ve floresan kargo taşınmasını ölçmek için ilgilenilen bir aksonal bölge görüntülenir.

Ücretsiz olarak kullanılabilen bir ImageJ makrosu olan KymoAnalyzer'ı kullanarak, tümü patolojik proteinlerin varlığından etkilenebilecek aksonal taşımanın hızını, duraklama frekansını ve yönlü kargo yoğunluğunu kapsamlı bir şekilde karakterize ediyoruz. Bu yöntem sayesinde, patolojik tau proteininin ekspresyonu ile ilişkili artmış kargo duraklama sıklığının bir fenotipini tanımlarız. Ek olarak, diğer proteinlerin taşıma bozulmasına aracılık etmedeki rolünü test etmek için transfeksiyon karışımına gen susturucu shRNA yapıları eklenebilir. Bu protokol, diğer nörodejeneratif hastalıkla ilişkili proteinlerle kullanım için kolayca uyarlanabilir ve bu proteinlerin aksonal taşımayı nasıl bozduğunun mekanizmalarını incelemek için tekrarlanabilir bir yöntemdir.

Introduction

Nöronlar, fonksiyonel sinapsları ve sinirsel bağlantıyı sürdürmek için akson boyunca yükün çift yönlü taşınmasına bağlıdır. Aksonal transport eksikliklerinin, Alzheimer hastalığı (AD) ve diğer tauopatiler, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı^dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patogenezine kritik katkıda bulunduğu düşünülmektedir ^1,2,3. Gerçekten de, hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerdeki patolojik modifikasyonlar, taşımayı olumsuz yönde etkiler (^4'te gözden ge....

Protocol

Bu protokoller Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokol, C57BL / 6J arka planındaki Tau Knockout farelerine ve vahşi tip Sprague Dawley sıçanlarına başarıyla uygulanmıştır. Diğer suşlar da kabul edilebilir olmalıdır.

1. Birincil hipokampal nöron hasadı

1. Borat tamponunda (12,5 mM sodyum borat dekahidrat ve 50 mM borik asit) filtrelenmiş 0,5 mg / .......

Discussion

Çeşitli nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili çoklu patolojik proteinlerin nöronlarda hızlı aksonal transportu bozduğuna dair artan kanıtlar vardır. Bu, bu hastalıklar arasında potansiyel bir ortak nörotoksisite mekanizmasını temsil eder. Bu proteinlerin taşımayı bozma sürecini daha iyi anlamak için, belirli soruları ele almamıza izin veren araçlara ve modellere ihtiyacımız var. Burada tarif edilen yöntem, kemirgenlerden primer hipokampal nöronlarda kargo ta?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427