استخدام تصوير الخلايا الحية لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحصينية الأولية

Summary

نوضح هنا كيفية الجمع بين نقل الخلايا العصبية للقوارض الحصين الأولية مع التصوير البؤري للخلايا الحية لتحليل التأثيرات المرضية التي يسببها البروتين على النقل المحوري وتحديد المسارات الميكانيكية التي تتوسط هذه الآثار.

Abstract

يعد النقل ثنائي الاتجاه للشحنات على طول المحور العصبي أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي والخلايا العصبية السليمة. يتعطل النقل المحوري في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، وتكون الخلايا العصبية الإسقاطية معرضة بشكل خاص بسبب الحاجة إلى نقل المواد الخلوية لمسافات طويلة والحفاظ على كتلة محورية كبيرة. تؤثر التعديلات المرضية للعديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل ، بما في ذلك تاو ، β الأميلويد ، α-سينوكلين ، ديسموتاز الفائق الأكسيد ، وهنتنغتين ، مما يوفر آلية مشتركة محتملة تمارس من خلالها البروتينات المرضية سمية في المرض. طرق لدراسة هذه الآليات السامة ضرورية لفهم الاضطرابات التنكسية العصبية وتحديد التدخلات العلاجية المحتملة.

هنا ، يتم نقل الخلايا العصبية الحصين للقوارض الأولية المستزرعة مع بلازميدات متعددة لدراسة آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري السريع باستخدام التصوير البؤري للخلايا الحية لبروتينات الشحن الموسومة بالفلورسنت. نبدأ بحصاد وتفكك وزراعة الخلايا العصبية الحصين الأولية من القوارض. بعد ذلك ، نشارك في نقل الخلايا العصبية باستخدام تركيبات الحمض النووي البلازميد للتعبير عن بروتين الشحن الموسوم بالفلورسنت والنوع البري أو الطافر تاو (يستخدم كنموذج للبروتينات المرضية). يتم تحديد المحاور العصبية في الخلايا الحية باستخدام جسم مضاد يربط مجالا خارج الخلية من اللفافة العصبية ، وهو بروتين المقطع الأولي للمحور العصبي ، ويتم تصوير المنطقة المحورية ذات الأهمية لقياس نقل البضائع الفلورية.

باستخدام KymoAnalyzer ، وهو ماكرو ImageJ متاح مجانا ، نقوم بتوصيف السرعة وتردد الإيقاف المؤقت وكثافة الشحن الاتجاهية للنقل المحوري ، وكلها قد تتأثر بوجود البروتينات المرضية. من خلال هذه الطريقة ، نحدد النمط الظاهري لزيادة تردد توقف البضائع المرتبط بالتعبير عن بروتين تاو المرضي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة تركيبات shRNA لإسكات الجينات إلى مزيج النقل لاختبار دور البروتينات الأخرى في التوسط في تعطيل النقل. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام مع البروتينات الأخرى المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية وهو طريقة قابلة للتكرار لدراسة آليات كيفية تعطيل هذه البروتينات للنقل المحوري.

Introduction

تعتمد الخلايا العصبية على النقل ثنائي الاتجاه للبضائع على طول المحور العصبي للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي. يعتقد أن عجز النقل المحوري مساهم حاسم في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) واعتلالات التاوباثيات الأخرى ، ومرض باركنسون ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض هنتنغتون^1،2،3. في الواقع ، تؤثر التعديلات المرضية على العديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل (تمت مراجعته في ⁴). من الضروري تطوير طرق للتحقيق في الآليات التي تمارس بها البروتينات ا....

Protocol

تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على فئران Tau Knockout في خلفية C57BL / 6J وفئران Sprague Dawley من النوع البري. يجب أن تكون السلالات الأخرى مقبولة أيضا.

1. حصاد الخلايا العصبية ال.......

Discussion

هناك أدلة متزايدة على أن البروتينات المرضية المتعددة المرتبطة بمجموعة متنوعة من الاضطرابات التنكسية العصبية تعطل النقل العصبي السريع في الخلايا العصبية. وهذا يمثل آلية مشتركة محتملة للسمية العصبية عبر هذه الأمراض. لفهم العملية التي تعطل بها هذه البروتينات النقل بشكل ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427