Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Summary

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Abstract

Le transport bidirectionnel des cargaisons le long de l’axone est essentiel au maintien des synapses fonctionnelles, de la connectivité neuronale et des neurones sains. Le transport axonal est perturbé dans de multiples maladies neurodégénératives, et les neurones de projection sont particulièrement vulnérables en raison de la nécessité de transporter des matériaux cellulaires sur de longues distances et de maintenir une masse axonale substantielle. Les modifications pathologiques de plusieurs protéines liées à la maladie affectent négativement le transport, notamment la tau, la β amyloïde, la α-synucléine, la superoxyde dismutase et la huntingtine, fournissant un mécanisme commun potentiel par lequel les protéines pathologiques exercent une toxicité dans la maladie. Des méthodes d’étude de ces mécanismes toxiques sont nécessaires pour comprendre les troubles neurodégénératifs et identifier les interventions thérapeutiques potentielles.

Ici, des neurones primaires de l’hippocampe de rongeurs en culture sont co-transfectés avec plusieurs plasmides pour étudier les effets des protéines pathologiques sur le transport axonal rapide à l’aide de l’imagerie confocale de cellules vivantes de protéines cargo marquées par fluorescence. Nous commençons par la récolte, la dissociation et la culture des neurones primaires de l’hippocampe à partir de rongeurs. Ensuite, nous co-transfectons les neurones avec des constructions d’ADN plasmidique pour exprimer la protéine cargo marquée fluorescente et la protéine tau de type sauvage ou mutant (utilisée comme exemple de protéines pathologiques). Les axones sont identifiés dans les cellules vivantes à l’aide d’un anticorps qui se lie à un domaine extracellulaire de la neurofascine, une protéine du segment initial de l’axone, et une région axonale d’intérêt est imagée pour mesurer le transport de fret fluorescent.

À l’aide de KymoAnalyzer, une macro ImageJ disponible gratuitement, nous caractérisons de manière approfondie la vitesse, la fréquence de pause et la densité de cargaison directionnelle du transport axonal, qui peuvent toutes être affectées par la présence de protéines pathologiques. Grâce à cette méthode, nous identifions un phénotype d’augmentation de la fréquence des pauses de cargaison associé à l’expression de la protéine tau pathologique. De plus, des constructions de shRNA de silençage génique peuvent être ajoutées au mélange de transfection pour tester le rôle d’autres protéines dans la médiation de la perturbation du transport. Ce protocole est facilement adaptable pour être utilisé avec d’autres protéines liées à des maladies neurodégénératives et constitue une méthode reproductible pour étudier les mécanismes de perturbation du transport axonal par ces protéines.

Introduction

Les neurones dépendent du transport bidirectionnel de la cargaison le long de l’axone pour maintenir les synapses fonctionnelles et la connectivité neuronale. On pense que les déficits de transport axonal contribuent de manière essentielle à la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres tauopathies, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington ^1,2,3. En effet, les modifications pathologiques de plusieurs protéines liées à la maladie affecte....

Protocol

Ces protocoles ont été approuvés par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été appliqué avec succès à des souris Tau Knockout dans le fond C57BL/6J et à des rats Sprague Dawley de type sauvage. D’autres souches devraient également être acceptables.

1. Prélèvement de neurones primaires de l’hippocampe

1. Enduire une lame de chambre .......

Discussion

Il existe de plus en plus de preuves que de multiples protéines pathologiques associées à une variété de troubles neurodégénératifs perturbent le transport axonal rapide dans les neurones. Cela représente un mécanisme commun potentiel de neurotoxicité à ces maladies. Pour mieux comprendre le processus par lequel ces protéines perturbent le transport, nous avons besoin d’outils et de modèles qui nous permettent de répondre à des questions spécifiques. La méthode décri.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427