Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Zusammenfassung

Der bidirektionale Transport von Frachten entlang des Axons ist entscheidend für die Aufrechterhaltung funktioneller Synapsen, neuronaler Konnektivität und gesunder Neuronen. Der axonale Transport ist bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen gestört, und Projektionsneuronen sind besonders anfällig, da sie zelluläres Material über große Entfernungen transportieren und eine beträchtliche axonale Masse aufrechterhalten müssen. Pathologische Modifikationen mehrerer krankheitsbezogener Proteine wirken sich negativ auf den Transport aus, darunter Tau, Amyloid-β, α-Synuclein, Superoxiddismutase und Huntingtin, was einen potenziellen gemeinsamen Mechanismus darstellt, durch den pathologische Proteine Toxizität bei Krankheiten ausüben. Methoden zur Untersuchung dieser toxischen Mechanismen sind notwendig, um neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen und mögliche therapeutische Interventionen zu identifizieren.

Hier werden kultivierte primäre Nagetier-Hippocampus-Neuronen mit mehreren Plasmiden co-transfiziert, um die Auswirkungen pathologischer Proteine auf den schnellen axonalen Transport mithilfe der konfokalen Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen in lebenden Zellen zu untersuchen. Wir beginnen mit der Ernte, Dissoziation und Kultivierung von primären Hippocampus-Neuronen von Nagetieren. Dann transfizieren wir die Neuronen mit Plasmid-DNA-Konstrukten, um fluoreszenzmarkiertes Frachtprotein und Wildtyp- oder mutiertes Tau (das als Beispiel für pathologische Proteine verwendet wird) zu exprimieren. Axone werden in lebenden Zellen mit einem Antikörper identifiziert, der eine extrazelluläre Domäne des Neurofasan bindet, ein Axon-Anfangssegmentprotein, und eine axonale Region von Interesse wird abgebildet, um den fluoreszierenden Frachttransport zu messen.

Mit KymoAnalyzer, einem frei verfügbaren ImageJ-Makro, charakterisieren wir umfassend die Geschwindigkeit, die Pausenfrequenz und die gerichtete Frachtdichte des axonalen Transports, die alle durch das Vorhandensein pathologischer Proteine beeinflusst werden können. Mit dieser Methode identifizieren wir einen Phänotyp einer erhöhten Häufigkeit von Frachtpausen, die mit der Expression von pathologischem Tau-Protein verbunden sind. Darüber hinaus können dem Transfektionsmix Gen-Silencing-shRNA-Konstrukte hinzugefügt werden, um die Rolle anderer Proteine bei der Vermittlung von Transportstörungen zu testen. Dieses Protokoll lässt sich leicht für die Verwendung mit anderen Proteinen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen anpassen und ist eine reproduzierbare Methode, um die Mechanismen zu untersuchen, wie diese Proteine den axonalen Transport stören.

Einleitung

Neuronen sind auf den bidirektionalen Transport von Fracht entlang des Axons angewiesen, um funktionelle Synapsen und neuronale Konnektivität aufrechtzuerhalten. Es wird angenommen, dass axonale Transportdefizite entscheidend zur Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen beitragen, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD) und andere Tauopathien, die Parkinson-Krankheit, die amyotrophe Lateralsklerose und die Huntington-Krankheit ^1,2,3. Tatsächlich wirken sich pathologische Modifikationen mehrerer krankheitsbezogener Proteine negativ auf den Transport aus (überprüft in ⁴). Die Entwicklung von Methoden zur Untersuchung der Mechanismen, durch die pathologische Proteine Toxizität bei Krankheiten ausüben, ist notwendig, um neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen und potenzielle Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren.

Mehrere wichtige Erkenntnisse über den Axontransport, einschließlich der Entdeckung von konventionellem Kinesin, den Kinase- und Phosphatase-abhängigen Signalwegen, die Motorproteine regulieren, und Mechanismen, durch die pathologische Proteine die Regulation des Axontransports stören, wurden mit dem isolierten Tintenfisch-Axoplasma-Modell ^4,5 gewonnen. Die Perfusion des Tintenfisch-Axoplasmas mit pathologischen Formen des Tau-Proteins hemmt den anterograden schnellen axonalen Transport (FAT), ein Effekt, der von der Exposition der Phosphatase-aktivierenden Domäne von Tau abhängt, die die Proteinphosphatase 1 (PP1)^6,7,8 aktiviert. PP1 aktiviert die Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3), die wiederum Kinesin-Leichtketten phosphoryliert, was zur Freisetzung von Fracht führt. Ein weiteres pathologisches Protein bei AD ist Amyloid-β. Oligomere Formen von Amyloid-β hemmen bidirektionale FAT durch Caseinkinase 2, die Kinesin-Leichtketten phosphoryliert⁹. Darüber hinaus stören pathologische Huntingtin-Proteine, die eine Polyglutamin-Expansion beherbergen, und eine familiäre ALS-verknüpfte SOD1-Mutante jeweils den axonalen Transport im Axoplasma des Tintenfischs durch die c-Jun N-terminale Kinase bzw. die p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Aktivität^10,11.

Während das Tintenfisch-Axoplasma-Modell nach wie vor ein wertvolles Werkzeug ist, um die Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport zu verstehen, verhindert der begrenzte Zugang zu den Geräten und Proben, dass es breiter eingesetzt wird. Wir haben einen Transportassay entwickelt, bei dem die konfokale Mikroskopie von primären Neuronen von Nagetieren (Maus und Ratte) verwendet wird. Dieses Modell stellt einen leicht anpassbaren und manipulierbaren neuronenbasierten Ansatz für Säugetiere dar, der weit verbreitete Zellquellen und Mikroskopiesysteme verwendet. Zum Beispiel wird eine Vielzahl von pathologischen Proteinen (z. B. die krankheitsbedingte Modifikationen beherbergen) exprimiert, um zu identifizieren, wie spezifische Modifikationen dieser Proteine den Transport in Axonen beeinflussen. In ähnlicher Weise kann eine Vielzahl von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen verwendet werden, um frachtspezifische Veränderungen zu untersuchen. Darüber hinaus lassen sich die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen relativ einfach untersuchen, indem die Expression (d.h. Knockdown oder Überexpression) ausgewählter Proteine, die diese Effekte vermitteln können, gezielt untersucht wird. Diese Methode lässt sich auch leicht an primäre Neuronen anpassen, die aus einer Vielzahl von Tiermodellen stammen.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, das den Axontransport-Assay für lebende Zellen beschreibt, der zuvor in primären Hippocampus-Neuronen verwendet wurde, um zu zeigen, dass mutierte Tau-Proteine, die mit frontotemporalen Lobärdemenzen assoziiert sind (FTLD; P301L oder R5L tau) erhöhen die Pausenfrequenz von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen bidirektional¹². Darüber hinaus rettete der Knockdown der PP1γ-Isoform die Pausierungseffekte¹². Dies unterstützt das Modell der pathologischen Tau-induzierten Störung, die durch eine aberrante Aktivierung eines durch PP1 initiierten Signalwegs vermittelt wird, wie oben beschrieben ^6,7,12. In einer separaten Studie zeigten wir, dass die Pseudophosphorylierung von Tau an S199/S202/T205 (dem pathogenen AT8-Phosphoepitop, das für Tauopathien relevant ist) die Häufigkeit der Frachtpausen und die anterograde Segmentgeschwindigkeit erhöhte. Diese Effekte hingen von der N-terminalen Phosphatase-aktivierenden Domäne von Tau¹³ ab. Diese Beispiele unterstreichen die Nützlichkeit dieses Modells für die Identifizierung der Mechanismen, wie pathologische Proteine den Axontransport in Säugetierneuronen stören.

Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der Methode, beginnend mit der Ernte, Dissoziation und Kultivierung von primären Hippocampus-Neuronen der Maus, gefolgt von der Transfektion der Neuronen mit Frachtproteinen, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert sind, und schließlich dem Ansatz der Lebendzellbildgebung und Bildanalyse. Wir zeigen beispielsweise, wie diese Methode verwendet wird, um die Auswirkungen von modifiziertem Tau auf den bidirektionalen Transport des vesikelassoziierten Proteins Synaptophysin zu untersuchen. Es gibt jedoch Flexibilität in dem pathogenen Protein und dem Transportfrachtprotein, die von Interesse sind, was dies zu einem vielseitigen Ansatz zur Untersuchung des axonalen Transports macht.

Protokoll

Diese Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf Tau-Knockout-Mäuse im C57BL/6J-Hintergrund und Wildtyp-Sprague-Dawley-Ratten angewendet. Andere Stämme sollten ebenfalls akzeptabel sein.

1. Primäre Neuronenentnahme im Hippocampus

1. Beschichten Sie einen 4-Well-Objektträger mit Glasbodenkammer mit gefiltertem 0,5 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) in Boratpuffer (12,5 mM Natriumborat-Decahydrat und 50 mM Borsäure). 750 μl/Vertiefung zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Waschen Sie den Kammerobjektträger 4x mit sterilem entionisiertem Wasser. Nach der letzten Wäsche an der Luft trocknen und zur kurzfristigen Lagerung (<1 Woche) bei 4 °C aufbewahren.
   HINWEIS: Lassen Sie das PDL vor und zwischen den Wäschen nicht auf dem Objektträger trocknen, da dies für die Kulturen giftig ist. Wir stellen fest, dass eine längerfristige Lagerung von PDL-beschichteten Objektträgern die neuronale Gesundheit beeinträchtigen kann und dass die Beibehaltung konsistenter Intervalle zwischen Beschichtung und Beschichtung die Variabilität der Kultur zwischen den Durchläufen reduziert.
3. Besorge dir eine zeitlich trächtige Maus oder Ratte.
   HINWEIS: Zeitträchtige Tiere können bei verschiedenen Firmen bestellt oder im eigenen Haus gezüchtet werden. Der embryonale Tag Null bezieht sich auf den Tag, an dem der Vaginalpfropfen gefunden wird, und wir hatten Erfolg bei der Kultivierung von E16-18-primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Maus mit diesem Ansatz. Rattenneuronen werden ebenfalls am embryonalen Tag 18 entnommen.
4. Bei E18 wird die trächtige Frau nach einer zugelassenen Methode eingeschläfert. Schneide durch die Bauchdecke und entferne die beiden Gebärmutterhörner. Geben Sie sie in eine Petrischale mit eiskalter 0,9%iger Kochsalzlösung. Spülen, bis die Kochsalzlösung sauber ist.
   HINWEIS: Wir verabreichen eine Überdosis Natrium-Pentobarbital (mindestens 100 mg/kg) über intraperitoneale Injektion.
5. Enthaupte die Welpen. Beginnen Sie am Foramen magnum (der Öffnung im hinteren Teil des Schädels), verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um die Haut und den Schädel entlang der Mittellinie zu schneiden, und winkeln Sie die untere Spitze der Schere gegen den inneren Teil des Schädels ab, um Schäden am Gehirngewebe zu vermeiden.
6. Entfernen Sie die darüber liegende Haut und entfernen Sie vorsichtig den Schädel, um das Gehirn freizulegen.
7. Halten Sie den Mund-/Nasenbereich mit einer Pinzette fest und drehen Sie den Schädel so, dass das Gehirn nach unten über eine mit 0,9 % Kochsalzlösung gefüllte Petrischale zeigt. Klappen Sie das Gehirn aus dem Schädel heraus und durchtrennen Sie die Nerven und den Hirnstamm, um das Gehirn in die Kochsalzlösung freizusetzen.
8. Legen Sie die Petrischale unter ein Präpariermikroskop, um den Hippocampus zu dissektionieren. Führen Sie eine Schere in die Mittellinie des Gehirns ein, winkeln Sie die Schere so an, dass die obere Klinge eine der Gehirnhälften nach außen drückt, und schneiden Sie, um die Hemisphäre von den subkortikalen Regionen zu trennen.
9. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch den Kortex, so dass der frontale Kortex vor und der Hippocampus hinter der Schnittstelle liegt. Führen Sie die untere Spitze der Schere in das entstandene Loch ein und schneiden Sie vorsichtig entlang der Spitze der Rinde, die am hinteren Ende endet.
10. Schwenken Sie mit der Pinzette vorsichtig die Rinde aus und beenden Sie den hinteren Schnitt. Der Hippocampus sollte einer Sichelform ähneln. Schneiden Sie die verbleibende Rinde vorsichtig ab, damit der Hippocampus seine runde, sichelförmige Form beibehält.
11. Entfernen Sie mit Pinzette und Schere vorsichtig die Hirnhäute aus dem Hippocampus.
    HINWEIS: Es ist wichtig, alle Hirnhäute aus dem Gehirn zu entfernen, um die Anzahl der nicht-neuronalen Zellen zu reduzieren, die gesammelt werden, ohne das Hippocampusgewebe zu beschädigen oder zu zerreißen.
12. Schneiden Sie den Hippocampus in vier gleich große Stücke und geben Sie das Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit eiskaltem kalzium- und magnesiumfreiem Puffer (CMF; Dulbeccos PBS mit 0,1 % Glukose, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 50 μg/ml Gentamicin).
    HINWEIS: Für beste Ergebnisse sammeln Sie die Hippocampi von 5-10 Welpen pro Dissoziation. Jeder Hippocampus sollte etwa 300.000 Zellen für Mäuse und 500.000 Zellen für Ratten liefern.

2. Dissoziation und Plattierung der primären Neuronen im Hippocampus

1. Entfernen Sie die CMF mit einer Pasteur-Pipette und spülen Sie das Tuch mit frischer, kalter CMF 4x aus und schwenken Sie es zwischen den Spülgängen vorsichtig.
2. Entfernen Sie den CMF und fügen Sie 3 ml gefilterte 0,125%ige Trypsinlösung hinzu (verdünnen Sie 2,5% Trypsin in vorgewärmter [37 °C] CMF). Inkubieren Sie das Gewebe genau 15 Minuten lang bei 37 °C; Alle 5 Min. vorsichtig schwenken.
   HINWEIS: Stellen Sie die Trypsinlösung unmittelbar vor Gebrauch her.
3. Bereiten Sie 5 ml Trypsin-Inaktivierungslösung (TIS; Hanks' Balanced Salt Solution, 20% Serum für neugeborene Kälber und 1x DNase I Lösung [10x Stamm: 5 mM Natriumacetat, 1 μM Calciumchlorid, 0,5 mg/mL DNase I]).
4. Die Trypsinlösung entfernen und 2x mit kaltem CMF waschen. Fügen Sie 3 ml kaltes TIS hinzu.
5. Dissoziieren Sie die Zellen durch Verreibung mit einer 3-ml-Spritze mit Nadeln mit immer kleinerem Durchmesser: 30x mit einer 14-G-Nadel, 30x mit einer 15-G-Nadel, 20x mit einer 16-G-Nadel, 20x mit einer 18-G-Nadel und 15x mit einer 21-G-Nadel. Mit den ersten vier Nadeln 2 Züge und mit der 21 G Nadel 3 Züge verwenden.
   HINWEIS: Es können auch andere Verfahren der Verreibung (z. B. feuerpolierte Glaspipetten^{14, 15}) verwendet werden. Wir stellen fest, dass die Verwendung der standardisierten Metallspritzennadeln die Variabilität der Zellverklumpung und -viabilität erheblich reduziert.
6. Geben Sie mit der 21-G-Nadel ein Tröpfchen der Zellsuspension auf einen Objektträger und prüfen Sie, ob sich Zellklumpen bilden. Wenn mehrere Klumpen beobachtet werden, drei weitere Male durch eine 22 G Nadel zerreiben und erneut prüfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis eine homogene einzellige Suspension erhalten ist, wobei darauf zu achten ist, dass sie während des gesamten Prozesses leicht verreibt.
7. Filtrieren Sie 5 ml fötales Rinderserum (FBS) mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig in einem konischen 15-ml-Röhrchen auf das FBS. Die Zellen (200 × g bei 4 °C) 5 min zentrifugieren.
8. Entfernen Sie so viel FBS wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie in 1 mL warmem (37 °C) antibiotikafreiem neurobasalem Medium (NBM; ergänzt mit 1x Glutaminersatz und 1x B-27).
9. Verdünnen Sie die Zellsuspension in Trypanblau (0,4 %) und erhalten Sie eine Zellzahl.
   HINWEIS: Eine 1:1-Verdünnung eignet sich gut für einen automatischen Zellzähler und eine 1:60-Verdünnung für die manuelle Zählung mit einem Hämazytometer. Um mit der Zellplatinierung fortzufahren, sollte die Lebensfähigkeit der Neuronen zu diesem Zeitpunkt höher als 90 % sein. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit einer gesunden Neuronenkultur nach der Dissoziation erheblich.
10. Plattieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 175.000 Zellen/Well (70.000 Zellen/^{mm 2}) in einem vorgewärmten PDL-beschichteten Vier-Well-Kammerobjektträger in 750 μl antibiotikafreiem NBM. Zusätzlich werden 200.000 Zellen/Well in vier Vertiefungen einer PDL-beschichteten 24-Well-Platte in 1,5 ml antibiotikafreiem NBM zur Verwendung als konditioniertes Medium bei der in Abschnitt 3 beschriebenen Transfektion plattiert. Inkubieren Sie die Zellen in einer Kammer mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit bei 37 °C und 5 % CO₂ .
    HINWEIS: Die Dichte der Zellen kann basierend auf den Ergebnissen angepasst werden. Hohe Dichten können die Abbildung der Neuronen erschweren, während niedrige Dichten die Gesundheit der Kultur und das Überleben der Neuronen negativ beeinflussen können. Unserer Erfahrung nach können Rattenneuronen im Vergleich zu Mausneuronen mit einer geringeren Dichte plattiert werden.

3. Transfektion von Neuronen

HINWEIS: Neuronen können auf DIV 7 oder DIV 8 transfiziert werden, ohne dass sich die Transfektionseffizienz oder die Transportergebnisse nennenswert ändern. Diese Volumina gelten für vier Vertiefungen eines Objektträgers mit vier Vertiefungen mit Glasboden und einem Volumen von 750 μl/Vertiefung. Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion unter Verwendung von Lipidtransfektionsreagenzien. Lassen Sie Medien und Transfektionsreagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen.

1. Bereiten Sie das Transfektions-Stammreagenz vor, indem Sie 4,4 μl Transfektionsreagenz zu 127,6 μl reduziertem Serummedium hinzufügen. Zum Mischen vorsichtig von Hand schütteln und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
2. Bereiten Sie DNA-Stämme während der Inkubation der Lipidtransfektion vor. 200 ng fluoreszierende Fracht-DNA (pFIN mApple-Synaptophysin; 12.112 Basenpaare) und 200 ng DNA zur Expression des interessierenden Proteins (verwendete Tau-Plasmide waren pCMV-Tau-Flag-Konstrukte; 5.036 Basenpaare) in reduziertes Serum oder serumfreies Medium bis zu einem Endvolumen von 32 μl^{hinzufügen 12}. Fügen Sie 0,8 μl Transfektionsverstärker-Reagenz hinzu (2 μl pro μg DNA). Mit der Hand gut vermischen.
   HINWEIS: Wir sind der Meinung, dass ein Derivat von RFP am besten funktioniert (mApple oder mCherry), aber GFP kann auch verwendet werden. Zusätzlich kann ein DNA-Konstrukt zur Expression einer gen-silencing small hairpin RNA (shRNA) eingeschlossen werden, um Mechanismen von Phänotypen zu testen, die bei der Expression des interessierenden Proteins beobachtet wurden. Nehmen Sie dazu 150 ng von jedem der drei DNA-Konstrukte in den DNA-Mix auf und passen Sie die Menge des Transfektionsverstärker-Reagenzes entsprechend an. Die Änderung der Parameter des DNA- oder Lipofektionsreagenzes kann die Transfektionseffizienz beeinflussen und kann je nach Bedarf an mehr oder weniger effizienten Transfektionen angepasst werden.
3. Geben Sie 32 μl Lipidtransfektionsmischung in jedes DNA-Röhrchen. Zum Mischen vorsichtig mit der Hand wiegen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Geben Sie langsam 64 μl DNA/Transfektionsreagenzmischung in die Zellen, indem Sie die Spitze der Pipette knapp unter der Oberfläche des Mediums platzieren und in einer Serpentinenbewegung durch die Vertiefung bewegen. Schaukeln Sie den Kammerschieber 3x nach der Zugabe in alle Vertiefungen vorsichtig von Hand, um weiter zu mischen und stellen Sie den Kammerschieber in den Inkubator. Bei 37 °C und 5 % CO₂ 2 h inkubieren.
   HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit, die sich Neuronen außerhalb des Inkubators befinden, da sie sehr empfindlich auf Änderungen der Temperatur und des pH-Werts reagieren, die schnell auftreten können.
5. Führen Sie 2 Stunden nach der Transfektion einen halben Mediumwechsel mit konditioniertem Medium + Neurofascin-Antikörper durch. Unmittelbar vor dem Mediumwechsel werden 1,5 ml konditioniertes antibiotikafreies NBM aus den auf der 24-Well-Platte kultivierten Zellen in einen Pool gefüllt. Geben Sie 0,75 μl Antikörper Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/ml) in das konditionierte Medium.
   HINWEIS: Der NF-186-Antikörper weist eine extrazelluläre Domäne des Neurofascins nach, die im Axon-Anfangssegment (AIS) angereichert ist, um das Axon für die Bildgebung definitiv zu identifizieren.
6. Führen Sie 18 Stunden nach der Transfektion einen vollständigen Mediumwechsel mit konditioniertem Medium durch, das den Sekundärantikörper enthält. Fügen Sie 1 μl Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, konjugiert mit AlexaFluor 647, zu 3 ml konditioniertem NBM (antibiotikafrei) aus der 24-Well-Platte hinzu. Gut mischen.

4. Bildgebung von Neuronen

1. Bereiten Sie sich 2 Tage nach der Transfektion auf die Bildgebung vor. Erwärmen Sie den Lebendzellkammeraufsatz für das konfokale Mikroskop auf 37 °C (einschließlich des 60x Objektivs und des Linsenöls) und äquilibrieren Sie die Kammer auf 5 % CO₂.
2. Verwenden Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und eine Lebendzellkammer, um die Zellen abzubilden.
   HINWEIS: Wir verwenden ein 60x 1,40 NA-Objektiv an einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, aber auch andere konfokale (z. B. rotierende Scheibe) oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopiesysteme können verwendet werden, wenn sie in der Lage sind, hohe Bildraten zu erzielen.
3. Identifizieren Sie transfizierte Neuronen in dem Kanal, der das Frachtprotein enthält, visuell mit den Okularen. Als Nächstes bilden Sie die Neuronen ab, um das AIS im Cy5-Kanal zu identifizieren (Abbildung 1).
4. Stellen Sie das Sichtfeld auf ein rechteckiges Feld von 32 x 128 Pixeln ein und verschieben Sie es so, dass es einen Bereich des Axons abbildet, der ~50-150 μm distal zum AIS liegt. Notieren und protokollieren Sie die Richtungsabhängigkeit des Gütertransports und die Ausrichtung des ROI. Die Punkte auf dem Feld werden oben bzw. rechts in allen nachfolgenden Bildern und Filmen angezeigt. Notieren Sie, welche Seite des Bildes dem Zellkörper am nächsten und welche dem Axonterminus am nächsten ist, damit die Kymographen-Polylinie in Schritt 5.1 mit der richtigen Ausrichtung gezeichnet werden kann.
   HINWEIS: Bei der Auswahl des interessierenden Bereichs sollte der abgebildete Bereich eines isolierten Axons relativ gerade sein und das Sichtfeld an jedem Ende schneiden. Das gesamte Segment sollte sich innerhalb derselben Fokusebene befinden. Der Bereich sollte deutlich den aktiven Transport von Gütern anzeigen. Übermäßig helle Neuronen exprimieren typischerweise das Frachtprotein und die Proteine von Interesse in Mengen, die für das Neuron wahrscheinlich toxisch sind und vermieden werden sollten.
5. Stellen Sie die Laserleistung von 561 auf 1,40, die Lochblende auf 7,8, die Größe auf 128 px² und die Geschwindigkeit auf 32 Bilder/s ein. Passen Sie die Verstärkung an, um den Transport einzelner Frachtvesikel zu visualisieren, ohne dass er durch Hintergrundsignale verdeckt wird (typischerweise zwischen 10 und 50 ergibt hochwertige Kymographen).
   HINWEIS: Die extrem niedrige Laserleistung ist durch hochempfindliche GaAsP-Detektoren erreichbar und verhindert mögliche phototoxische Effekte und Photobleiche von bewegter Fracht. Die Lochblende wird so breit wie möglich eingestellt, um die Fokustiefe zu erhöhen und sicherzustellen, dass der gesamte ROI abgebildet wird, da das Axon möglicherweise nicht perfekt flach auf der Oberfläche des Objektträgers liegt.
6. Legen Sie den ROI fest, indem Sie im Dropdown-Menü ROI die Option Rechteckigen ROI zeichnen... auswählen. Zeichnen Sie den ROI so, dass er das gesamte Sichtfeld abdeckt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den ROI und wählen Sie Als Stimulations-ROI verwenden: S1.
7. Bereiten Sie das ND-Setup vor, indem Sie die folgenden Schritte auf der Registerkarte ND-Setup einfügen.
   HINWEIS: Dies ist das fünfstufige Erfassungsprotokoll, das einmal eingerichtet wird und dann von der Software jedes Mal durchgeführt wird, wenn die Filme gesammelt werden.
   1. Bild erfassen , um das Referenzbild der Vorstimulation zu erfassen.
   2. Anregung; ROI: S1; Intervall: NoDelay; Dauer 1.64 s, Schleifen: 7. In diesem Schritt wird die Hintergrundfluoreszenz mit mehreren Pulsen des Lasers gebleicht.
   3. Bild erfassen. In diesem Schritt wird ein Referenzbild nach der Stimulation aufgenommen.
   4. Warten; Keine Aktion; 2 Min. Dieser Schritt bietet eine Erholungsphase für fluoreszierende Fracht, um den gebleichten ROI wieder zu bevölkern.
   5. Erwerb; Intervall: NoDelay; Dauer 5 min, Loops: 8.615. In diesem Schritt werden Bilder mit der maximalen Rate für den Bildgebungszeitraum von 5 Minuten erfasst.
8. Nachdem das ND Setup-Protokoll eingerichtet wurde, klicken Sie auf der Registerkarte ND Setup auf die Schaltfläche Stimulationseinstellungen anwenden. Klicken Sie auf Jetzt ausführen, wenn Sie bereit sind, den Frachttransport abzubilden. Dadurch wird das ND-Erfassungsprotokoll aus Schritt 4.7 gestartet.
   HINWEIS: Obwohl die Bildrate auf 32 Bilder/s eingestellt ist, kann die praktische Bildrate langsamer sein (~28,7 Bilder/s). Dieser Wert sollte für eine genaue Kymographenanalyse in Abschnitt 5 aufgezeichnet werden. Im Idealfall wird die Bildgebung des Lebendzelltransports mit der schnellstmöglichen Bildrate (z. B. >25 Bilder/s) durchgeführt, um Frachtbewegungen besser zu entschlüsseln.
9. Setzen Sie das Sichtfeld auf das gesamte Bild zurück. Sammeln und speichern Sie dann ein Bild des vollständigen Neurons in den Kanälen 561 und 647 mit der ROI-Box. Notieren Sie die XY-Koordinaten, an denen das Bild aufgenommen wurde, um die Expression des interessierenden Proteins nach der Fixierung zu bestätigen.
10. Sammeln Sie Transportvideos von mindestens zwei Neuronen zur Analyse. Stellen Sie sicher, dass jedes unabhängige Replikat aus den Mitteln von Variablen stammt, die aus einer einzelnen primären Neuronenernte (d. h. nicht aus einzelnen Neuronen) gemessen wurden.
    HINWEIS: Für eine gegebene primäre Neuronenernte sammeln wir Videos von 2-4 Neuronen pro Bedingung.
11. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie das Medium entfernen und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit vorgewärmtem 4%igem Paraformaldehyd inkubieren. Entfernen Sie den Puffer und waschen Sie die Zellen jeweils 3 x 5 min in TBS.
    HINWEIS: Für die Paraformaldehyd-Fixierung verwenden wir Zytoskelett-Puffer, einen gängigen Puffer, der die Zytoskelettstruktur aufrechterhält (10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ und 4 mM EGTA, pH 6,1). Andere Puffer (z. B. TBS, PBS) können ebenfalls zur Fixierung verwendet werden.
12. Bestätigen Sie, dass die analysierten Neuronen sowohl das Protein von Interesse als auch das fluoreszenzmarkierte Frachtprotein durch Immunzytofluoreszenzfärbung exprimieren. Färbung für humanes Tau (Tau12) zur Bestätigung der exogenen Tau-Expression und β-III-Tubulin (Tuj1) zur Bestätigung, dass die Neuronen während des gesamten Bildgebungsprozesses gesund blieben.
    HINWEIS: Wir beobachten die Koexpression beider DNA-Konstrukte in fast allen transfizierten Zellen mit diesen Methoden.

5. Generieren und Analysieren von Kymographen

HINWEIS: Kymographen können mit einer Vielzahl unterschiedlicher Programme erstellt und analysiert werden. Wir beschreiben kurz die frei verfügbare Software KymoAnalyzer (v. 1.01) mit sechs ImageJ (v. 1.51n) Plugins¹⁶. Diese Plugins können von den Entwicklern auf der Encalada-Lab-Website (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer) heruntergeladen werden. Ausführlichere Anweisungen zur Verwendung dieser Software finden Sie auf dieser Website.

1. Gruppieren Sie die in Schritt 4.9 erzeugten Filme basierend auf experimentellen Bedingungen und replizieren Sie sie. Führen Sie das Makro BatchKymographGeneration aus, und wählen Sie den entsprechenden Ordner aus. Zeichnen Sie eine Kymographen-Polylinie, um das Axon beginnend mit dem proximalen Ende in diesem bestimmten Bild zu verfolgen. Die resultierenden Kymographen werden im ausgewählten Ordner abgelegt (Abbildung 2).
2. Weisen Sie Spuren manuell zu, indem Sie das Makro "Spuren" ausführen, einen einzelnen Filmordner auswählen, Ja auswählen, um eine Spur hinzuzufügen, und dann klicken, um die Flugbahn der einzelnen Partikel zu verfolgen. Führen Sie den ersten Klick am oberen Rand der Spur aus und klicken Sie erneut auf jeden Punkt, an dem das Partikel die Geschwindigkeit oder Richtung ändert, sodass die Polylinie die Spur des Partikels auf dem Kymographen überlagert. Nachdem die Polylinie über die gesamte Spur gelegt wurde, klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Spuren zugewiesen sind.
3. Führen Sie die restlichen Makros aus, und weisen Sie die Bildrate und die Pixelgröße basierend auf den Bildgebungsparametern zu. Führen Sie zuerst CargoPopulation, dann NetCargoPopulation und dann Segments aus. Geben Sie die Pixelgröße und die Bildrate der Filme ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden (0,22 μm bzw. 28,7 Bilder/s mit diesen Einstellungen). Führen Sie abschließend das makro poolData aus, um die Transportparameterdaten aller Kymographen im ausgewählten Ordner zu berechnen und zu poolen.
4. Plotten Sie die Ergebnisse aus den Datendateien und vergleichen Sie die verschiedenen Bedingungen mit den unabhängigen Replikaten, die durch die Mittelwerte aller analysierten Neuronen innerhalb einer experimentellen Bedingung für eine einzelne Neuronenernte dargestellt werden.

Ergebnisse

Mit diesen Methoden haben wir den axonalen Transport in Gegenwart von Wildtyp- oder krankheitsbezogenen Formen des Tau-Proteins charakterisiert, um mögliche Mechanismen pathologischer Tau-induzierter Neurotoxizität bei Erkrankungen^{zu untersuchen 12,13}. Die KymoAnalyzer-Software berechnet und bündelt eine Vielzahl unterschiedlicher Parameter aus allen Kymographen innerhalb eines Ordners. Die Transportraten werden nur berechnet,...

Diskussion

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass mehrere pathologische Proteine, die mit einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind, den schnellen axonalen Transport in Neuronen stören. Dies stellt einen potenziellen gemeinsamen Mechanismus der Neurotoxizität bei diesen Krankheiten dar. Um den Prozess, durch den diese Proteine den Transport stören, besser zu verstehen, brauchen wir Werkzeuge und Modelle, die es uns ermöglichen, spezifische Fragen zu beantworten. Die h...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427