Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Zusammenfassung

Der bidirektionale Transport von Frachten entlang des Axons ist entscheidend für die Aufrechterhaltung funktioneller Synapsen, neuronaler Konnektivität und gesunder Neuronen. Der axonale Transport ist bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen gestört, und Projektionsneuronen sind besonders anfällig, da sie zelluläres Material über große Entfernungen transportieren und eine beträchtliche axonale Masse aufrechterhalten müssen. Pathologische Modifikationen mehrerer krankheitsbezogener Proteine wirken sich negativ auf den Transport aus, darunter Tau, Amyloid-β, α-Synuclein, Superoxiddismutase und Huntingtin, was einen potenziellen gemeinsamen Mechanismus darstellt, durch den pathologische Proteine Toxizität bei Krankheiten ausüben. Methoden zur Untersuchung dieser toxischen Mechanismen sind notwendig, um neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen und mögliche therapeutische Interventionen zu identifizieren.

Hier werden kultivierte primäre Nagetier-Hippocampus-Neuronen mit mehreren Plasmiden co-transfiziert, um die Auswirkungen pathologischer Proteine auf den schnellen axonalen Transport mithilfe der konfokalen Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen in lebenden Zellen zu untersuchen. Wir beginnen mit der Ernte, Dissoziation und Kultivierung von primären Hippocampus-Neuronen von Nagetieren. Dann transfizieren wir die Neuronen mit Plasmid-DNA-Konstrukten, um fluoreszenzmarkiertes Frachtprotein und Wildtyp- oder mutiertes Tau (das als Beispiel für pathologische Proteine verwendet wird) zu exprimieren. Axone werden in lebenden Zellen mit einem Antikörper identifiziert, der eine extrazelluläre Domäne des Neurofasan bindet, ein Axon-Anfangssegmentprotein, und eine axonale Region von Interesse wird abgebildet, um den fluoreszierenden Frachttransport zu messen.

Mit KymoAnalyzer, einem frei verfügbaren ImageJ-Makro, charakterisieren wir umfassend die Geschwindigkeit, die Pausenfrequenz und die gerichtete Frachtdichte des axonalen Transports, die alle durch das Vorhandensein pathologischer Proteine beeinflusst werden können. Mit dieser Methode identifizieren wir einen Phänotyp einer erhöhten Häufigkeit von Frachtpausen, die mit der Expression von pathologischem Tau-Protein verbunden sind. Darüber hinaus können dem Transfektionsmix Gen-Silencing-shRNA-Konstrukte hinzugefügt werden, um die Rolle anderer Proteine bei der Vermittlung von Transportstörungen zu testen. Dieses Protokoll lässt sich leicht für die Verwendung mit anderen Proteinen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen anpassen und ist eine reproduzierbare Methode, um die Mechanismen zu untersuchen, wie diese Proteine den axonalen Transport stören.

Einleitung

Neuronen sind auf den bidirektionalen Transport von Fracht entlang des Axons angewiesen, um funktionelle Synapsen und neuronale Konnektivität aufrechtzuerhalten. Es wird angenommen, dass axonale Transportdefizite entscheidend zur Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen beitragen, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD) und andere Tauopathien, die Parkinson-Krankheit, die amyotrophe Lateralsklerose und die Huntington-Krankheit ^1,2,3. Tatsächlich wirken sich pathologische Modifikationen mehrerer krankheitsbezogener Proteine nega....

Protokoll

Diese Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf Tau-Knockout-Mäuse im C57BL/6J-Hintergrund und Wildtyp-Sprague-Dawley-Ratten angewendet. Andere Stämme sollten ebenfalls akzeptabel sein.

1. Primäre Neuronenentnahme im Hippocampus

1. Beschichten Sie einen 4-Well-Objektträger mit Glasbodenkammer mit gefiltertem 0,5 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) in Boratpuffer (12,5 mM Natriumborat-Decahydrat und 50 mM Borsäure). 750 μl/Vertiefung zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
....

Ergebnisse

Mit diesen Methoden haben wir den axonalen Transport in Gegenwart von Wildtyp- oder krankheitsbezogenen Formen des Tau-Proteins charakterisiert, um mögliche Mechanismen pathologischer Tau-induzierter Neurotoxizität bei Erkrankungen^{zu untersuchen 12,13}. Die KymoAnalyzer-Software berechnet und bündelt eine Vielzahl unterschiedlicher Parameter aus allen Kymographen innerhalb eines Ordners. Die Transportraten werden nur berechnet,.......

Diskussion

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass mehrere pathologische Proteine, die mit einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind, den schnellen axonalen Transport in Neuronen stören. Dies stellt einen potenziellen gemeinsamen Mechanismus der Neurotoxizität bei diesen Krankheiten dar. Um den Prozess, durch den diese Proteine den Transport stören, besser zu verstehen, brauchen wir Werkzeuge und Modelle, die es uns ermöglichen, spezifische Fragen zu beantworten. Die h.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427