שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

Summary

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

Abstract

הובלה דו-כיוונית של מטענים לאורך האקסון חיונית לשמירה על סינפסות תפקודיות, קישוריות עצבית ותאי עצב בריאים. ההובלה האקסונלית משובשת במחלות נוירודגנרטיביות מרובות, ונוירוני הקרנה פגיעים במיוחד בגלל הצורך להעביר חומרים תאיים למרחקים ארוכים ולשמור על מסה אקסונלית משמעותית. שינויים פתולוגיים של מספר חלבונים הקשורים למחלות משפיעים לרעה על התחבורה, כולל טאו, עמילואיד-β, α-סינוקלאין, סופראוקסיד דיסמוטאז והנטינגטין, ומספקים מנגנון משותף פוטנציאלי שבאמצעותו חלבונים פתולוגיים מפעילים רעילות במחלות. שיטות לחקור מנגנונים רעילים אלה נחוצים כדי להבין הפרעות נוירודגנרטיביות ולזהות התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

כאן, נוירוני היפוקמפוס ראשוניים של מכרסמים בתרבית נגועים יחד עם פלסמידים מרובים כדי לחקור את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על הובלה אקסונלית מהירה באמצעות הדמיה קונפוקלית של תאים חיים של חלבוני מטען מתויגים פלואורסצנטית. אנו מתחילים עם הקציר, הדיסוציאציה והטיפוח של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ממכרסמים. לאחר מכן, אנו מבצעים טרנספורמציה משותפת של תאי העצב עם מבני דנ"א פלסמידים כדי לבטא חלבון מטען מתויג פלואורסצנטי וטאו פראי או מוטנטי (המשמש כדוגמה לחלבונים פתולוגיים). אקסונים מזוהים בתאים חיים באמצעות נוגדן הקושר תחום חוץ-תאי של נוירופאשין, חלבון מקטע ראשוני של אקסון, ואזור עניין אקסונלי מדומה למדידת הובלת מטענים פלואורסצנטיים.

באמצעות KymoAnalyzer, מאקרו ImageJ הזמין באופן חופשי, אנו מאפיינים בהרחבה את המהירות, תדירות ההשהיה וצפיפות המטען הכיוונית של הובלה אקסונלית, שכולם עשויים להיות מושפעים מנוכחותם של חלבונים פתולוגיים. באמצעות שיטה זו, אנו מזהים פנוטיפ של תדירות השהיית מטען מוגברת הקשורה לביטוי של חלבון טאו פתולוגי. בנוסף, ניתן להוסיף מבני shRNA להשתקת גנים לתמהיל הטרנספקציה כדי לבחון את תפקידם של חלבונים אחרים בתיווך שיבוש ההובלה. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לשימוש עם חלבונים אחרים הקשורים למחלות נוירודגנרטיביות והוא שיטה ניתנת לשחזור לחקר המנגנונים של האופן שבו חלבונים אלה משבשים את ההובלה האקסונלית.

Introduction

תאי עצב תלויים בהובלה דו-כיוונית של מטען לאורך האקסון כדי לשמור על סינפסות תפקודיות וקישוריות עצבית. ליקויים בהובלה אקסונלית נחשבים לתורמים קריטיים לפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD) וטאואופתים אחרים, מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת הנטינגטון ^1,2,3. ואכן, שינויים פתולוגיים במספר חלבונים הקשורים למחלות משפיעים לרעה על התחבורה (נסקר ב ^-4). פיתוח שיטות לחקר המנגנונים שבאמצעותם חלבונים פתולוגיים מפעילים רעילות במחלות נחוץ כדי להבין הפרעות נוירודגנרטיביות ולזהות מטרות פוטנציאליות להתע....

Protocol

פרוטוקולים אלה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה יושם בהצלחה על עכברי Tau Knockout על רקע C57BL/6J וחולדות Sprague Dawley מסוג Wild. זנים אחרים צריכים להיות מקובלים גם כן.

1. קציר נוירונים ראשוני בהיפוקמפוס

1. צ?.......

Discussion

ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שחלבונים פתולוגיים מרובים הקשורים למגוון הפרעות נוירודגנרטיביות משבשים את התחבורה האקסונלית המהירה בנוירונים. זה מייצג מנגנון משותף פוטנציאלי של רעילות עצבית על פני מחלות אלה. כדי להבין טוב יותר את התהליך שבו החלבונים האלה משבשים את השינו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427