प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में axonal परिवहन पर रोग प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करना

Summary

यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक्सोनल परिवहन पर पैथोलॉजिकल प्रोटीन-प्रेरित प्रभावों का विश्लेषण करने और इन प्रभावों की मध्यस्थता करने वाले यंत्रवत मार्गों की पहचान करने के लिए लाइव-सेल कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ प्राथमिक हिप्पोकैम्पस कृंतक न्यूरॉन्स के अभिकर्मक को कैसे संयोजित किया जाए।

Abstract

अक्षतंतु के साथ कार्गो का द्विदिश परिवहन कार्यात्मक synapses, तंत्रिका कनेक्टिविटी और स्वस्थ न्यूरॉन्स को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक्सोनल परिवहन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में बाधित होता है, और प्रक्षेपण न्यूरॉन्स लंबी दूरी पर सेलुलर सामग्री के परिवहन और पर्याप्त अक्षीय द्रव्यमान को बनाए रखने की आवश्यकता के कारण विशेष रूप से कमजोर होते हैं। कई रोग से संबंधित प्रोटीनों के पैथोलॉजिकल संशोधन परिवहन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं, जिसमें ताऊ, एमिलॉयड -β, α-सिंक्यूक्लिन, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज और हंटिंगटिन शामिल हैं, जो एक संभावित सामान्य तंत्र प्रदान करते हैं जिसके द्वारा रोग संबंधी प्रोटीन रोग में विषाक्तता डालते हैं। न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों को समझने और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों की पहचान करने के लिए इन विषाक्त तंत्रों का अध्ययन करने के तरीके आवश्यक हैं।

यहां, सुसंस्कृत प्राथमिक कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को फ्लोरोसेंटली-टैग कार्गो प्रोटीन के लाइव-सेल कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके तेजी से अक्षीय परिवहन पर पैथोलॉजिकल प्रोटीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए कई प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है। हम कृन्तकों से प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की फसल, पृथक्करण और संवर्धन के साथ शुरू करते हैं। फिर, हम फ्लोरोसेंट-टैग कार्गो प्रोटीन और जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती ताऊ (रोग प्रोटीन के एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है) को व्यक्त करने के लिए प्लास्मिड डीएनए निर्माणों के साथ न्यूरॉन्स को सह-ट्रांसफ़ेक्ट करते हैं। एक्सॉन को एक एंटीबॉडी का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में पहचाना जाता है जो न्यूरोफासिन के एक बाह्य डोमेन को बांधता है, एक अक्षतंतु प्रारंभिक खंड प्रोटीन, और फ्लोरोसेंट कार्गो परिवहन को मापने के लिए ब्याज के एक अक्षीय क्षेत्र को चित्रित किया जाता है।

KymoAnalyzer का उपयोग करना, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ मैक्रो, हम बड़े पैमाने पर वेग, ठहराव आवृत्ति, और axonal परिवहन के दिशात्मक कार्गो घनत्व की विशेषता है, जो सभी रोग प्रोटीन की उपस्थिति से प्रभावित हो सकता है. इस पद्धति के माध्यम से, हम पैथोलॉजिकल ताऊ प्रोटीन की अभिव्यक्ति से जुड़े बढ़े हुए कार्गो पॉज़ आवृत्ति के फेनोटाइप की पहचान करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीन-साइलेंसिंग shRNA निर्माणों को परिवहन व्यवधान की मध्यस्थता में अन्य प्रोटीनों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए अभिकर्मक मिश्रण में जोड़ा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग से संबंधित प्रोटीन के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलनीय है और उन प्रोटीनों के अक्षीय परिवहन को बाधित करने के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है।

Introduction

न्यूरॉन्स कार्यात्मक synapses और तंत्रिका कनेक्टिविटी बनाए रखने के लिए अक्षतंतु के साथ कार्गो के द्विदिश परिवहन पर निर्भर करते हैं। एक्सोनल परिवहन घाटे को अल्जाइमर रोग (एडी) और अन्य ताउओपैथिस, पार्किंसंस रोग, एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस और हंटिंगटन रोग ^1,2,3 सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के रोगजनन में महत्वपूर्ण योगदानकर्ता माना जाता है। दरअसल, कई रोग से संबंधित प्रोटीनों में पैथोलॉजिकल संशोधन परिवहन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते ^{हैं (4} में समीक्षा की गई). उन तंत्रों की जांच करने के तरीकों का विकास करना ....

Protocol

इन प्रोटोकॉल मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. इस प्रोटोकॉल को C57BL/6J पृष्ठभूमि और जंगली प्रकार के स्प्रेग डॉली चूहों में ताऊ नॉकआउट ?.......

Discussion

इस बात के बढ़ते प्रमाण हैं कि विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से जुड़े कई रोग प्रोटीन न्यूरॉन्स में तेजी से अक्षीय परिवहन को बाधित करते हैं। यह इन बीमारियों में न्यूरोटॉक्स?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427