Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Summary

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Abstract

Il trasporto bidirezionale dei carichi lungo l'assone è fondamentale per mantenere le sinapsi funzionali, la connettività neurale e i neuroni sani. Il trasporto assonale è interrotto in diverse malattie neurodegenerative e i neuroni di proiezione sono particolarmente vulnerabili a causa della necessità di trasportare materiali cellulari su lunghe distanze e sostenere una notevole massa assonale. Le modificazioni patologiche di diverse proteine correlate alla malattia influenzano negativamente il trasporto, tra cui tau, amiloide-β, α-sinucleina, superossido dismutasi e huntingtina, fornendo un potenziale meccanismo comune attraverso il quale le proteine patologiche esercitano tossicità nella malattia. I metodi per studiare questi meccanismi tossici sono necessari per comprendere i disturbi neurodegenerativi e identificare potenziali interventi terapeutici.

Qui, i neuroni dell'ippocampo primario di roditori in coltura vengono co-trasfettati con plasmidi multipli per studiare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale veloce utilizzando l'imaging confocale su cellule vive di proteine cargo marcate in fluorescenza. Iniziamo con la raccolta, la dissociazione e la coltura dei neuroni primari dell'ippocampo dai roditori. Quindi, co-trasfettiamo i neuroni con costrutti di DNA plasmidico per esprimere la proteina cargo marcata con fluorescenza e la tau wild-type o mutante (usata come esempio di proteine patologiche). Gli assoni vengono identificati nelle cellule vive utilizzando un anticorpo che lega un dominio extracellulare di neurofascina, una proteina del segmento iniziale dell'assone e una regione assonale di interesse viene visualizzata per misurare il trasporto di merci fluorescenti.

Utilizzando KymoAnalyzer, una macro ImageJ disponibile gratuitamente, caratterizziamo ampiamente la velocità, la frequenza di pausa e la densità di carico direzionale del trasporto assonale, che possono essere influenzate dalla presenza di proteine patologiche. Attraverso questo metodo, identifichiamo un fenotipo di aumento della frequenza di pausa del carico associato all'espressione della proteina tau patologica. Inoltre, i costrutti di shRNA di silenziamento genico possono essere aggiunti al mix di trasfezione per testare il ruolo di altre proteine nella mediazione dell'interruzione del trasporto. Questo protocollo è facilmente adattabile per l'uso con altre proteine correlate alla malattia neurodegenerativa ed è un metodo riproducibile per studiare i meccanismi di come tali proteine interrompono il trasporto assonale.

Introduction

I neuroni dipendono dal trasporto bidirezionale del carico lungo l'assone per mantenere le sinapsi funzionali e la connettività neurale. Si ritiene che i deficit del trasporto assonale contribuiscano in modo critico alla patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e altre taupatie, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la malattia di Huntington ^1,2,3. Infatti, le modifiche patologiche di diverse proteine correlate alla malattia influenzano negativamente il trasporto (rivisto in

Protocol

Questi protocolli sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Michigan State University. Questo protocollo è stato applicato con successo a topi Tau Knockout nel background C57BL/6J e a ratti Sprague Dawley wild-type. Anche altri ceppi dovrebbero essere accettabili.

1. Prelievo di neuroni primari dell'ippocampo

1. Rivestire un vetrino a 4 pozzetti con poli-d-lisina (PDL) filtrata da 0,5 mg/mL.......

Discussion

Ci sono prove crescenti che più proteine patologiche associate a una varietà di malattie neurodegenerative interrompono il trasporto assonale veloce nei neuroni. Ciò rappresenta un potenziale meccanismo comune di neurotossicità in queste malattie. Per comprendere meglio il processo attraverso il quale queste proteine interrompono il trasporto, abbiamo bisogno di strumenti e modelli che ci permettano di affrontare domande specifiche. Il metodo qui descritto consente l'esame dei meccan.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427