生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

Summary

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。

Abstract

軸索に沿った貨物の双方向輸送は、機能的なシナプス、神経接続、および健康なニューロンを維持するために重要です。軸索輸送は複数の神経変性疾患で中断され、投射ニューロンは、細胞材料を長距離輸送し、かなりの軸索質量を維持する必要があるため、特に脆弱です。タウ、アミロイドβ、α-シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ、ハンチンチンなど、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼし、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮する可能性のある共通のメカニズムを提供します。これらの毒性メカニズムを研究する方法は、神経変性疾患を理解し、潜在的な治療介入を特定するために必要です。

ここでは、培養した初代げっ歯類の海馬ニューロンを複数のプラスミドと同時トランスフェクトし、蛍光タグ付きカーゴタンパク質の生細胞共焦点イメージングを使用して、病理学的タンパク質が高速軸索輸送に及ぼす影響を研究します。私たちは、げっ歯類からの初代海馬ニューロンの採取、解離、および培養から始めます。次に、ニューロンにプラスミドDNAコンストラクトを共トランスフェクションして、蛍光タグ付きカーゴタンパク質と野生型または変異型のタウ(病理学的タンパク質の例として使用)を発現させます。軸索は、ニューロファシンの細胞外ドメインである軸索初期セグメントタンパク質に結合する抗体を使用して生細胞で同定され、関心のある軸索領域を画像化して蛍光カーゴ輸送を測定します。

無料で入手できるImageJマクロであるKymoAnalyzerを使用して、病理学的タンパク質の存在によって影響を受ける可能性のある軸索輸送の速度、一時停止頻度、および指向性貨物密度を広範囲に特徴付けます。この方法により、病理学的タウタンパク質の発現に関連するカーゴ一時停止頻度の増加の表現型を特定します。さらに、遺伝子サイレンシングshRNAコンストラクトをトランスフェクションミックスに添加して、輸送妨害の媒介における他のタンパク質の役割を試験することができます。このプロトコルは、他の神経変性疾患関連タンパク質との使用に容易に適応でき、これらのタンパク質が軸索輸送をどのように妨害するかのメカニズムを研究するための再現性のある方法です。

Introduction

ニューロンは、機能的なシナプスと神経接続を維持するために、軸索に沿った貨物の双方向輸送に依存しています。軸索輸送障害は、アルツハイマー病(AD)やその他のタウオパチー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチン^{トン病など}、いくつかの神経変性疾患の病因に重大な貢献をしていると考えられています^1,2,3。実際、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼします(⁴)でレビュー。神経変性疾患を理解し、治療介入の潜在的な標的を特定するためには、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮するメカニズムを調査する方法を開発する必要があります。

従来のキネシンの発見、運動タンパク質を調節するキナーゼおよびホスファターゼ依存性経路、病理学的タンパク質が軸索輸送の調節を妨害するメカニズムなど、軸索輸送に関するいくつかの重要な洞察が、単離されたイカ軸索形質モデル^4,5を用いてなされた。イカの軸索形質と病理学的形態のタウタンパク質との灌流は、前向性高速軸索輸送(F....

Protocol

これらのプロトコルは、ミシガン州立大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。このプロトコルは、C57BL/6JバックグラウンドのTau Knockoutマウスおよび野生型Sprague Dawleyラットにうまく適用されています。他の株も同様に許容できるはずです。

1. 初代海馬ニューロンの採取

1. 4ウェルガラス底チャンバース?.......

Discussion

さまざまな神経変性疾患に関連する複数の病理学的タンパク質が、ニューロンの高速軸索輸送を妨害するという証拠が増えています。これは、これらの疾患に共通する神経毒性のメカニズムである可能性を表しています。これらのタンパク質が輸送を妨害するプロセスをよりよく理解するには、特定の問題に対処できるツールとモデルが必要です。ここで説明する方.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427