Produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura

Summary

I fibroblasti isolati dal cuore umano adulto sono stati coltivati fino alla confluenza su piastre rivestite di gelatina per produrre la matrice extracellulare specifica del miocardio. Dopo la decellularizzazione, questo substrato può essere utilizzato per la coltura e lo studio di altre cellule cardiache e delle interazioni cellula-matrice.

Abstract

Il miocardio è composto da cardiomiociti e da un numero ancora maggiore di fibroblasti, questi ultimi responsabili della produzione di matrice extracellulare. Dalle prime fasi dello sviluppo cardiaco per tutta la vita, sia in condizioni normali che patologiche, la composizione della matrice extracellulare cambia e influenza la struttura e la funzione del miocardio. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di ottenere il substrato per la coltura di cellule cardiache in vitro (chiamato ECM cardiaca), imitando la matrice extracellulare miocardica in vivo. A tal fine, i fibroblasti isolati dal cuore umano adulto sono stati coltivati per confluenza su piastre rivestite di gelatina per produrre la matrice extracellulare specifica del miocardio. La successiva rimozione dei fibroblasti cardiaci, preservando la MEC cardiaca depositata, ha prodotto il substrato per studiare l'influenza della matrice extracellulare specifica del miocardio su altre cellule. È importante sottolineare che la composizione del rivestimento derivato dai fibroblasti della piastra di coltura cambia in base all'attività in vivo dei fibroblasti isolati dal cuore, consentendo successivi studi sulle interazioni cellula-matrice in diverse condizioni normali e patologiche.

Introduction

Tutte le cellule si trovano in vivo in un microambiente specializzato in cui possono sopravvivere e svolgere le loro funzioni specifiche. All'interno di un dato tessuto, le cellule sono circondate da una matrice extracellulare composta da proteine fibrillari e non fibrillari e da sostanze fondamentali ricche di glicosaminoglicani¹. I cambiamenti qualitativi e quantitativi nel contenuto della matrice influenzano la biologia cellulare, controllando processi come la proliferazione cellulare, l'apoptosi, la migrazione o la differenziazione. Pertanto, gli sforzi sono investiti nella ricreazione di questo mi....

Protocol

I tessuti cardiaci sono stati ottenuti da pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale dovuta a cardiopatia ischemica sottoposti a trapianto di cuore. Tutti i campioni utilizzati per gli esperimenti sono stati raccolti con il consenso del paziente e senza identificatori del paziente, seguendo i protocolli approvati dal comitato etico dell'Università degli Studi di Napoli Federico II e in conformità con i principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki. I dettagli di tut.......

Discussion

I fibroblasti isolati da campioni di cuore umano sono stati coltivati alla confluenza per 21 giorni per sintetizzare e depositare la matrice extracellulare, formando uno strato coesivo saldamente aderente alla superficie della piastra di coltura. La successiva rimozione dei fibroblasti cardiaci, preservando la MEC cardiaca depositata, ha prodotto il substrato per studiare l'influenza della matrice extracellulare specifica del miocardio su altre cellule all'interno del tessuto cardiaco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes