Получение сердечного внеклеточного матрикса из фибробластов взрослого человека для покрытия культуральных чашек

Summary

Фибробласты, выделенные из сердца взрослого человека, культивировали для слияния на посудах, покрытых желатином, для получения специфичного для миокарда внеклеточного матрикса. После децеллюляризации этот субстрат может быть использован для культивирования и изучения других сердечных клеток и клеточно-матриксных взаимодействий.

Abstract

Миокард состоит из кардиомиоцитов и еще большего количества фибробластов, последние отвечают за продукцию внеклеточного матрикса. С ранних стадий развития сердца на протяжении всей жизни, как в норме, так и при патологии, состав внеклеточного матрикса изменяется и влияет на структуру и функцию миокарда. Целью описанного здесь метода является получение субстрата для культивирования сердечных клеток in vitro (называемого сердечной ВКМ), имитирующего внеклеточный матрикс миокарда in vivo. С этой целью фибробласты, выделенные из сердца взрослого человека, культивировали до слияния на посудах, покрытых желатином, для получения специфичного для миокарда внеклеточного матрикса. Последующее удаление сердечных фибробластов с сохранением отложенной сердечной ВКМ позволило получить субстрат для изучения влияния миокард-специфичного внеклеточного матрикса на другие клетки. Важно отметить, что состав фибробластного покрытия чашки для культуры изменяется в зависимости от активности in vivo фибробластов, выделенных из сердца, что позволяет впоследствии изучать клеточно-матриксные взаимодействия в различных нормальных и патологических условиях.

Introduction

Все клетки расположены in vivo в специализированной микросреде, в которой они могут выживать и выполнять свои специфические функции. В любой ткани клетки окружены внеклеточным матриксом, состоящим из фибриллярных и нефибриллярных белков, а также основных веществ, богатых гликозаминогликанами^. Качественные и количественные изменения в составе матрицы влияют на клеточную биологию, контролируя такие процессы, как пролиферация клеток, апоптоз, миграция или дифференцировка. Следовательно, усилия направлены на воссоздание этого микроокружения для исследований in vitro клеток из различных тканей

Protocol

Сердечные ткани были получены от пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности из-за ишемической кардиопатии, которым проводилась трансплантация сердца. Все образцы, использованные для экспериментов, были собраны с согласия пациента и без его идентифи.......

Discussion

Фибробласты, выделенные из образцов сердца человека, культивировали до слияния в течение 21 дня для синтеза и депонирования внеклеточного матрикса, образуя когезивный слой, прочно прилегающий к поверхности культуральной пластины. Последующее удаление сердечных фибр.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes