Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Summary

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Abstract

Gli studi in vivo sul comportamento dei tumori sono un punto fermo della ricerca sul cancro; Tuttavia, l'uso dei topi presenta sfide significative in termini di costi e tempo. Qui, presentiamo il pesce zebra larvale come un modello di trapianto che presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli murini, tra cui facilità di manipolazione, bassa spesa e breve durata sperimentale. Inoltre, l'assenza di un sistema immunitario adattativo durante gli stadi larvali ovvia alla necessità di generare e utilizzare ceppi immunodeficienti. Sebbene esistano protocolli consolidati per lo xenotrapianto in embrioni di zebrafish, presentiamo qui un metodo migliorato che coinvolge la stadiazione degli embrioni per un trasferimento più rapido, l'analisi della sopravvivenza e l'uso della citometria a flusso per valutare il carico della malattia. Gli embrioni vengono messi in scena per facilitare l'iniezione rapida di cellule nel tuorlo delle larve e la marcatura delle cellule per monitorare la consistenza del bolo cellulare iniettato. Dopo l'iniezione, l'analisi della sopravvivenza dell'embrione viene valutata fino a 7 giorni dopo l'iniezione (dpi). Infine, il carico di malattia viene valutato anche marcando le cellule trasferite con una proteina fluorescente e analizzando mediante citometria a flusso. La citometria a flusso è resa possibile da un metodo standardizzato di preparazione di sospensioni cellulari da embrioni di zebrafish, che potrebbe essere utilizzato anche per stabilire la coltura primaria di cellule di zebrafish. In sintesi, la procedura qui descritta consente una valutazione più rapida del comportamento delle cellule tumorali in vivo con un numero maggiore di animali per braccio di studio e in modo più economico.

Introduction

L'analisi del comportamento dei tumori in risposta ad alterazioni genetiche o al trattamento farmacologico in vivo è un elemento essenziale della ricerca sul cancro 1,2,3,4. Tali studi comportano il più delle volte l'uso di modelli murini immunocompromessi (Mus musculus)⁵; Tuttavia, gli studi sugli xenotrapianti nei topi sono limitati sotto molti aspetti, tra cui capacità limitata, durata prolungata, spese significative e la necessità di sofisticate apparecchiature di imaging per monitorare la progre....

Protocol

Il mantenimento, l'alimentazione e l'allevamento del pesce zebra sono avvenuti in condizioni di acquacoltura standard a 28,5 °C, come descritto³¹. Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra sono stati fatti a questa temperatura; tuttavia, dopo lo xenotrapianto, gli animali sono stati coltivati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento, in conformità con le procedure approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).

1. Allevam.......

Discussion

Lo xenotrapianto di pesce zebra è emerso come un'alternativa rapida, robusta ed economica agli studi sui topi¹². Sebbene siano stati riportati diversi approcci allo xenotrapianto di pesce zebra, il nostro adattamento ha portato a miglioramenti significativi. Oltre a standardizzare i parametri relativi alla procedura, questi miglioramenti si concentrano specificamente sull'accelerazione della velocità con cui possono essere eseguite le iniezioni tumorali, consentendo così un aumento del numero d.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763