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Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.
Estudos in vivo do comportamento do tumor são um elemento básico da pesquisa do câncer; no entanto, o uso de camundongos apresenta desafios significativos em custo e tempo. Aqui, apresentamos o peixe-zebra larval como um modelo de transplante que apresenta inúmeras vantagens sobre os modelos murinos, incluindo facilidade de manuseio, baixo custo e curta duração experimental. Além disso, a ausência de um sistema imunológico adaptativo durante os estágios larvais evita a necessidade de gerar e usar cepas imunodeficientes. Embora existam protocolos estabelecidos para xenotransplante em embriões de peixe-zebra, apresentamos aqui um método aprimorado envolvendo o estadiamento embrionário para transferência mais rápida, análise de sobrevivência e o uso de citometria de fluxo para avaliar a carga da doença. Os embriões são preparados para facilitar a injeção rápida de células na gema das larvas e a marcação celular para monitorar a consistência do bolo celular injetado. Após a injeção, a análise de sobrevivência do embrião é avaliada até 7 dias após a injeção (dpi). Finalmente, a carga da doença também é avaliada marcando as células transferidas com uma proteína fluorescente e análise por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é possibilitada por um método padronizado de preparação de suspensões celulares de embriões de peixe-zebra, que também pode ser usado no estabelecimento da cultura primária de células de peixe-zebra. Em resumo, o procedimento descrito aqui permite uma avaliação mais rápida do comportamento das células tumorais in vivo com maior número de animais por braço de estudo e de maneira mais econômica.
A análise do comportamento dos tumores em resposta à alteração genética ou ao tratamento medicamentoso in vivo é um elemento essencial da pesquisa do câncer 1,2,3,4. Tais estudos geralmente envolvem o uso de modelos de camundongos imunocomprometidos (Mus musculus)5; No entanto, os estudos de xenotransplante em camundongos são limitados em muitos aspectos, incluindo capacidade limitada, duração prolongada, despesas significativas e a necessidade de equipamentos de imagem sofisticados para monitorar a ....
A manutenção, alimentação e criação do peixe-zebra ocorreram em condições padrão de aquicultura a 28,5 ° C, conforme descrito31. Todos os experimentos relacionados ao peixe-zebra foram feitos nessa temperatura; no entanto, após o xenotransplante, os animais foram cultivados a 34 °C durante o experimento, de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Reprodução (3 dias antes da injeção)<.......
Xenotransplante
Uma visão abrangente de todo o experimento e análise é representada na Figura 1, abrangendo desde a produção de embriões até a avaliação da progressão da doença por análise de sobrevivência e carga de doença por citometria de fluxo. Essa abordagem traz várias melhorias que aumentam a reprodutibilidade e escalabilidade do xenotransplante, além de adicionar uma nova maneira de avaliar a carga da doença. O sucesso desses experimentos é altam.......
O xenotransplante de peixe-zebra surgiu como uma alternativa rápida, robusta e econômica aos estudos com camundongos12. Embora várias abordagens para o xenotransplante de peixe-zebra tenham sido relatadas, nossa adaptação resultou em melhorias significativas. Além de padronizar os parâmetros em torno do procedimento, essas melhorias se concentram especificamente em acelerar a taxa na qual as injeções de tumor podem ser realizadas, permitindo assim um aumento no número de animais por bra?.......
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Este trabalho foi apoiado por doações do NIH R37AI110985 e P30CA006927, uma dotação da Comunidade da Pensilvânia, da Sociedade de Leucemia e Linfoma e do Fundo Bishop. Este estudo também foi apoiado pelas principais instalações da Fox Chase, incluindo Cultura de Células, Citometria de Fluxo e Instalações de Animais de Laboratório. Agradecemos à Dra. Jennifer Rhodes por manter a instalação de peixe-zebra e microinjeção na FCCC.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
FBS | Corning | 35-015-CV | |
Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
HBSS | Corning | 21-023-CV | |
Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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