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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Abstract

Condensados biomoleculares formados via separação de fase líquido-líquido (LLPS) têm sido considerados críticos na organização celular e em um número crescente de funções celulares. A caracterização da LLPS em células vivas também é importante porque a condensação aberrante tem sido associada a inúmeras doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. A LLPS é frequentemente impulsionada por interações seletivas, transitórias e multivalentes entre proteínas intrinsecamente desordenadas. De grande interesse são as dinâmicas de interação das proteínas participantes do LLPS, que são bem resumidas por medidas de seu tempo de residência de ligação (TR), ou seja, a quantidade de tempo que passam ligadas dentro dos condensados. Aqui, apresentamos um método baseado em imagens de célula única de célula viva que nos permite medir a RT média de uma proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultaneamente moléculas proteicas individuais e os condensados com os quais elas se associam, usamos rastreamento de partícula única (SPT) para traçar trajetórias de molécula única e, em seguida, ajustamos as trajetórias a um modelo de ligação proteína-gotícula para extrair o TR médio da proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos onde este método de imagem de molécula única foi aplicado para comparar as médias de RTs de uma proteína em seus condensados de LLPS quando fundida e não fundida a um domínio oligomerizante. Este protocolo é amplamente aplicável para medir a dinâmica de interação de qualquer proteína que participa de LLPS.

Introduction

Um crescente corpo de trabalhos sugere que os condensados biomoleculares desempenham um papel importante na organização celular e em numerosas funções celulares, por exemplo, regulação transcricional 1,2,3,4,5, reparo de danos ao DNA 6,7,8, organização da cromatina 9,10,11,12, cromossomo X

Protocol

1. Marcação de proteínas em células

  1. Expresse a proteína de interesse fusionada ao HaloTag na linhagem celular desejada.
  2. Expressam H2B marcados com Halo de forma estável no mesmo tipo de células que no 1.1 usando transposons ou transdução viral.

2. Preparação de lamínulas

  1. Antes de usar lamínulas para cultura celular, limpe as lamínulas para remover contaminantes autofluorescentes.
    1. Monte as tampas de 25 mm.......

Representative Results

Aqui, apresentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, onde utilizamos este protocolo de TCP para comparar a dinâmica de interação de duas proteínas em seus respectivos condensados de LLPS auto-montados. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contém um IDR que pode sofrer LLPS após superexpressão em células humanas. Nós hipotetizamos que a fusão de TAF15(IDR) com FTH1 (ferritin heavy chain 1), que forma um oligômero de 24 subunidades, levaria a interaçõe.......

Discussion

O protocolo aqui apresentado é projetado para sistemas como os investigados em Irgen-Gioro et al.40. Dependendo da aplicação, alguns componentes do protocolo podem ser modificados, por exemplo, o método de geração de linhagens celulares marcadas fluorescentemente, o sistema de marcação fluorescente e o estilo de lamínula usado. A marcação de uma proteína em uma célula pode ser feita usando duas estratégias, dependendo de qual é mais adequada para um determinado experimento. 1) Expre.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Bolsa Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. também é apoiado pelo NIH/NCI sob o número de prêmio P30CA016042.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m
Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R.

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