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Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.
Condensados biomoleculares formados via separação de fase líquido-líquido (LLPS) têm sido considerados críticos na organização celular e em um número crescente de funções celulares. A caracterização da LLPS em células vivas também é importante porque a condensação aberrante tem sido associada a inúmeras doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. A LLPS é frequentemente impulsionada por interações seletivas, transitórias e multivalentes entre proteínas intrinsecamente desordenadas. De grande interesse são as dinâmicas de interação das proteínas participantes do LLPS, que são bem resumidas por medidas de seu tempo de residência de ligação (TR), ou seja, a quantidade de tempo que passam ligadas dentro dos condensados. Aqui, apresentamos um método baseado em imagens de célula única de célula viva que nos permite medir a RT média de uma proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultaneamente moléculas proteicas individuais e os condensados com os quais elas se associam, usamos rastreamento de partícula única (SPT) para traçar trajetórias de molécula única e, em seguida, ajustamos as trajetórias a um modelo de ligação proteína-gotícula para extrair o TR médio da proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos onde este método de imagem de molécula única foi aplicado para comparar as médias de RTs de uma proteína em seus condensados de LLPS quando fundida e não fundida a um domínio oligomerizante. Este protocolo é amplamente aplicável para medir a dinâmica de interação de qualquer proteína que participa de LLPS.
Um crescente corpo de trabalhos sugere que os condensados biomoleculares desempenham um papel importante na organização celular e em numerosas funções celulares, por exemplo, regulação transcricional 1,2,3,4,5, reparo de danos ao DNA 6,7,8, organização da cromatina 9,10,11,12, cromossomo X
1. Marcação de proteínas em células
2. Preparação de lamínulas
Aqui, apresentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, onde utilizamos este protocolo de TCP para comparar a dinâmica de interação de duas proteínas em seus respectivos condensados de LLPS auto-montados. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contém um IDR que pode sofrer LLPS após superexpressão em células humanas. Nós hipotetizamos que a fusão de TAF15(IDR) com FTH1 (ferritin heavy chain 1), que forma um oligômero de 24 subunidades, levaria a interaçõe.......
O protocolo aqui apresentado é projetado para sistemas como os investigados em Irgen-Gioro et al.40. Dependendo da aplicação, alguns componentes do protocolo podem ser modificados, por exemplo, o método de geração de linhagens celulares marcadas fluorescentemente, o sistema de marcação fluorescente e o estilo de lamínula usado. A marcação de uma proteína em uma célula pode ser feita usando duas estratégias, dependendo de qual é mais adequada para um determinado experimento. 1) Expre.......
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Bolsa Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. também é apoiado pelo NIH/NCI sob o número de prêmio P30CA016042.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 µm TetraSpeck microsphere | Invitrogen | T7279 | Single-molecule imaging |
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips | Marienfeld Superior | 111650 | Preparation of coverslips |
593/40 nm bandpass filter | Semrock | FF01-593/40-25 | Single-molecule imaging |
676/37 nm bandpass filter | Semrock | FF01-676/37-25 | Single-molecule imaging |
6-Well TC Plate | Genesee | 25-105MP | Preparation of cells for microscopy |
Cell Line: U-2 OS | ATCC | HTB-96 | Labeling of proteins in cells |
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Coverglass Staining Rack | Thomas | 24957 | Preparation of coverslips |
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
DMEM, Low Glucose | Gibco | 10-567-022 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | Single-molecule imaging | |
Ethanol 200 Proof | Lab Alley | EAP200-1GAL | Preparation of coverslips |
evalSPT | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020 | ||
Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH30396.03 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Fiji | Analysis of single-molecule imaging data | ||
Ikon Ultra CCD Camera | Andor | X-13723 | Single-molecule imaging |
Longpass dichroic beamsplitter | Semrock | Di02-R635-25x36 | Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter |
LUN-F Laser Unit | Nikon | Single-molecule imaging: 405/488/561/640 | |
MatTek glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture. |
NIS-Elements | Nikon | Single-molecule imaging: Microscope acquisition software | |
nucleus and cluster mask_v2.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15-140-122 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Labeling of proteins in cells |
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
PLOT_ResidenceHist_css.m | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Potassium Hydroxide | Mallinckrodt Chemicals | 6984-06 | Preparation of coverslips |
pretracking_comb.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
SLIMfast | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016 | ||
Stage-top incubation system | Tokai Hit | Single-molecule imaging: For live-cell imaging | |
TwinCam dual emission image splitter | Cairn Research | Single-molecule imaging | |
Ultrasonic Cleaner | Branson | 5800 | Preparation of coverslips |
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