Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Summary

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Abstract

Condensados biomoleculares formados via separação de fase líquido-líquido (LLPS) têm sido considerados críticos na organização celular e em um número crescente de funções celulares. A caracterização da LLPS em células vivas também é importante porque a condensação aberrante tem sido associada a inúmeras doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. A LLPS é frequentemente impulsionada por interações seletivas, transitórias e multivalentes entre proteínas intrinsecamente desordenadas. De grande interesse são as dinâmicas de interação das proteínas participantes do LLPS, que são bem resumidas por medidas de seu tempo de residência de ligação (TR), ou seja, a quantidade de tempo que passam ligadas dentro dos condensados. Aqui, apresentamos um método baseado em imagens de célula única de célula viva que nos permite medir a RT média de uma proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultaneamente moléculas proteicas individuais e os condensados com os quais elas se associam, usamos rastreamento de partícula única (SPT) para traçar trajetórias de molécula única e, em seguida, ajustamos as trajetórias a um modelo de ligação proteína-gotícula para extrair o TR médio da proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos onde este método de imagem de molécula única foi aplicado para comparar as médias de RTs de uma proteína em seus condensados de LLPS quando fundida e não fundida a um domínio oligomerizante. Este protocolo é amplamente aplicável para medir a dinâmica de interação de qualquer proteína que participa de LLPS.

Introduction

Um crescente corpo de trabalhos sugere que os condensados biomoleculares desempenham um papel importante na organização celular e em numerosas funções celulares, por exemplo, regulação transcricional 1,2,3,4,5, reparo de danos ao DNA ^6,7,8, organização da cromatina ^9,10,11,12, cromossomo X

Protocol

1. Marcação de proteínas em células

1. Expresse a proteína de interesse fusionada ao HaloTag na linhagem celular desejada.
2. Expressam H2B marcados com Halo de forma estável no mesmo tipo de células que no 1.1 usando transposons ou transdução viral.

2. Preparação de lamínulas

1. Antes de usar lamínulas para cultura celular, limpe as lamínulas para remover contaminantes autofluorescentes.
   1. Monte as tampas de 25 mm.......

Discussion

O protocolo aqui apresentado é projetado para sistemas como os investigados em Irgen-Gioro et ^al.40. Dependendo da aplicação, alguns componentes do protocolo podem ser modificados, por exemplo, o método de geração de linhagens celulares marcadas fluorescentemente, o sistema de marcação fluorescente e o estilo de lamínula usado. A marcação de uma proteína em uma célula pode ser feita usando duas estratégias, dependendo de qual é mais adequada para um determinado experimento. 1) Expre.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips