Одномолекулярное измерение динамики взаимодействия белков в биомолекулярных конденсатах

Summary

Было показано, что многие внутренне неупорядоченные белки участвуют в образовании высокодинамичных биомолекулярных конденсатов, что важно для многих клеточных процессов. В данной работе мы представляем метод количественной оценки динамики, с помощью которой белки взаимодействуют друг с другом в биомолекулярных конденсатах в живых клетках, основанный на визуализации одной молекулы.

Abstract

Биомолекулярные конденсаты, образующиеся с помощью фазового разделения жидкость-жидкость (LLPS), считаются критически важными для клеточной организации и растущего числа клеточных функций. Характеристика LLPS в живых клетках важна еще и потому, что аберрантная конденсация связана со многими заболеваниями, включая рак и нейродегенеративные расстройства. LLPS часто обусловлен селективными, транзиторными и поливалентными взаимодействиями между внутренне неупорядоченными белками. Большой интерес представляет динамика взаимодействия белков, участвующих в LLPS, которая хорошо обобщается измерениями времени их пребывания в связях (RT), то есть количества времени, которое они проводят связанными в конденсатах. Здесь мы представляем метод, основанный на визуализации живых клеток одной молекулы, который позволяет измерить среднюю RT конкретного белка в конденсатах. Мы одновременно визуализируем отдельные белковые молекулы и конденсаты, с которыми они связаны, используем отслеживание одной частицы (SPT) для построения одномолекулярных траекторий, а затем подгоняем траектории к модели связывания белка с каплей для извлечения среднего RT белка. Наконец, мы показали репрезентативные результаты, в которых этот метод визуализации одной молекулы был применен для сравнения средних RT белка в его конденсатах LLPS при слиянии и неслиянии с олигомеризующим доменом. Этот протокол широко применим для измерения динамики взаимодействия любого белка, участвующего в LLPS.

Introduction

Растущее количество работ показывает, что биомолекулярные конденсаты играют важную роль в клеточной организации и многочисленных клеточных функциях, например, транскрипционная регуляция 1,2,3,4,5, восстановление повреждений ДНК ^6,7,8, организация хроматина ^9,10,11,12, Х-хромосома инактив....

Protocol

1. Мечение белков в клетках

1. Экспрессируйте интересующий белок, слившийся с HaloTag, в желаемой клеточной линии.
2. Стабильно экспрессировать Halo-меченый H2B в том же типе клеток, что и в 1.1, с помощью транспозонов или вирусной трансдукции.

2. Подготовка пок?.......

Discussion

Протокол, представленный здесь, предназначен для систем, подобных тем, которые исследованы в работе Irgen-Gioro et ^al.40. В зависимости от области применения некоторые компоненты протокола могут быть изменены, например, метод генерации флуоресцентно меченных клеточных линий, сист?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips