Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Было показано, что многие внутренне неупорядоченные белки участвуют в образовании высокодинамичных биомолекулярных конденсатов, что важно для многих клеточных процессов. В данной работе мы представляем метод количественной оценки динамики, с помощью которой белки взаимодействуют друг с другом в биомолекулярных конденсатах в живых клетках, основанный на визуализации одной молекулы.

Abstract

Биомолекулярные конденсаты, образующиеся с помощью фазового разделения жидкость-жидкость (LLPS), считаются критически важными для клеточной организации и растущего числа клеточных функций. Характеристика LLPS в живых клетках важна еще и потому, что аберрантная конденсация связана со многими заболеваниями, включая рак и нейродегенеративные расстройства. LLPS часто обусловлен селективными, транзиторными и поливалентными взаимодействиями между внутренне неупорядоченными белками. Большой интерес представляет динамика взаимодействия белков, участвующих в LLPS, которая хорошо обобщается измерениями времени их пребывания в связях (RT), то есть количества времени, которое они проводят связанными в конденсатах. Здесь мы представляем метод, основанный на визуализации живых клеток одной молекулы, который позволяет измерить среднюю RT конкретного белка в конденсатах. Мы одновременно визуализируем отдельные белковые молекулы и конденсаты, с которыми они связаны, используем отслеживание одной частицы (SPT) для построения одномолекулярных траекторий, а затем подгоняем траектории к модели связывания белка с каплей для извлечения среднего RT белка. Наконец, мы показали репрезентативные результаты, в которых этот метод визуализации одной молекулы был применен для сравнения средних RT белка в его конденсатах LLPS при слиянии и неслиянии с олигомеризующим доменом. Этот протокол широко применим для измерения динамики взаимодействия любого белка, участвующего в LLPS.

Introduction

Растущее количество работ показывает, что биомолекулярные конденсаты играют важную роль в клеточной организации и многочисленных клеточных функциях, например, транскрипционная регуляция 1,2,3,4,5, восстановление повреждений ДНК 6,7,8, организация хроматина 9,10,11,12, Х-хромосома инактив....

Protocol

1. Мечение белков в клетках

  1. Экспрессируйте интересующий белок, слившийся с HaloTag, в желаемой клеточной линии.
  2. Стабильно экспрессировать Halo-меченый H2B в том же типе клеток, что и в 1.1, с помощью транспозонов или вирусной трансдукции.

2. Подготовка пок?.......

Representative Results

Здесь мы представляем репрезентативные результаты работы Irgen-Gioro et al.40, где мы использовали этот протокол SPT для сравнения динамики взаимодействия двух белков в соответствующих самоорганизующихся конденсатах LLPS. TAF15 (TATA-box-связывающий белок-ассоциированный фактор 15) содерж?.......

Discussion

Протокол, представленный здесь, предназначен для систем, подобных тем, которые исследованы в работе Irgen-Gioro et al.40. В зависимости от области применения некоторые компоненты протокола могут быть изменены, например, метод генерации флуоресцентно меченных клеточных линий, сист?.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана стипендией Национального научного фонда в рамках гранта No. DGE-1745301 (S.Y.), Премия Pew-Stewart Scholar Award (Южная Каролина), Премия Searle Scholar Award (Южная Каролина), Исследовательский грант Фонда Шерла и Кей Курчи (Южная Каролина), Грант Merkin Innovation Seed Grant (Южная Каролина), Исследовательский грант Маллинкродта (Южная Каролина) и Маргарет Э. Грант Фонда ранних медицинских исследований 2024 года (Южная Каролина). S.C. также поддерживается NIH/NCI под номером P30CA016042.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m
Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R.

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved