השפעה אנטגוניסטית של Jiawei Shengjiang San על מודל חולדה של נפרופתיה סוכרתית: קשור למסלול איתות EGFR/MAPK3/1

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר פרמקולוגיה של רשת וטכניקות עגינה מולקולרית כדי לחקור את מנגנון הפעולה של Jiawei Shengjiang San (JWSJS) בטיפול בנפרופתיה סוכרתית.

Abstract

מטרתנו הייתה להתעמק במנגנונים העומדים בבסיס פעולתו של Jiawei Shengjiang San (JWSJS) בטיפול בנפרופתיה סוכרתית ובפריסת פרמקולוגיה רשתית. תוך שימוש בפרמקולוגיה של רשתות ובטכניקות עגינה מולקולריות, חזינו את המרכיבים והמטרות הפעילים של JWSJS ובנינו רשת קפדנית של "רכיבי תרופות-מטרה". אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוחי העשרה שימשו כדי להבחין במסלולים ובמטרות הטיפוליות של JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 נפרס לאימות עגינה מולקולרית, וסימולציית דינמיקה מולקולרית של 100-ns נערכה כדי לאשר את תוצאות העגינה, ואחריה אימות בעלי חיים in vivo . הממצאים גילו כי JWSJS שיתף 227 מטרות מצטלבות עם נפרופתיה סוכרתית, ובנה טופולוגיית רשת אינטראקציה חלבון-חלבון. ניתוח העשרה של KEGG ציין כי JWSJS מקל על נפרופתיה סוכרתית על ידי אפנון שומנים וטרשת עורקים, מסלול האיתות PI3K-Akt, אפופטוזיס ומסלול האיתות HIF-1, עם חלבון קינאז 1 המופעל על ידי מיטוגן (MAPK1), MAPK3, קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR), וסרין/תראונין-פרוטאין קינאז 1 (AKT1) שזוהו כמטרות קולקטיביות של מסלולים מרובים. עגינה מולקולרית טענה כי רכיבי הליבה של JWSJS (קוורצטין, חומצה פלמיטולאית ולוטאולין) יכולים לייצב קונפורמציה עם שלוש מטרות מרכזיות (MAPK1, MAPK3 ו-EGFR) באמצעות קשרי מימן. בדיקות In vivo הצביעו על עלייה ניכרת במשקל הגוף וירידה בחלבון סרום מסוכרר (GSP), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C), אורידין טריפוספט (UTP) ורמות גלוקוז בדם בצום (FBG) עקב JWSJS. מיקרוסקופ אלקטרונים יחד עם המטוקסילין ואוזין (HE) וצביעת חומצה תקופתית שיף (PAS) הדגישו את הפוטנציאל של כל קבוצת טיפול בהקלה על נזק לכליות בהיקפים שונים, והציגו ירידות מגוונות ב-p-EGFR, p-MAPK3/1 ו-BAX, ועליות בביטוי BCL-2 ברקמות הכליה של החולדות שטופלו. באופן חד משמעי, תובנות אלה מצביעות על כך שהיעילות המגנה של JWSJS על נפרופתיה סוכרתית עשויה להיות קשורה לדיכוי ההפעלה של מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1 ולהקלה על אפופטוזיס של תאי הכליה.

Introduction

סוכרת (DM) היא מחלה כרונית המשפיעה על מערכות מרובות ועלולה לגרום לסיבוכים שונים עקב היפרגליקמיה מתמשכת, כגון נפרופתיה סוכרתית (DN), רטינופתיה ונוירופתיה¹. DN הוא סיבוך חמור של DM, המהווה כ-30%-50% ממחלת כליות סופנית (ESRD)². הביטוי הקליני שלה הוא microalbuminuria, אשר יכול להתקדם ESRD מאופיין נפח גלומרולרי מוגבר, hyperplasia סטרומה mesangial, קרום מרתף גלומרולרי מעובה³. הפתוגנזה של DN היא מורכבת ולא הובהרה במלואה. שיטות קליניות כגון הורדת רמת הגלוקוז בדם, ויסות לחץ הדם והפחתת פרוטאינוריה משמשות בעיקר כדי לעכב את התקדמותה, אך ההשפעה היא כללית.

Protocol

כל בעלי החיים הוחזקו ושימשו בהתאם למדריך מועצת המחקר הלאומית של ארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה⁸, ודווחו כמומלץ בהנחיות ARRIVE^16,17. המחקר נערך בהתאם למדריך מועצת המחקר הלאומית של סין לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי ועדת הא.......

Discussion

המחקר שלנו השתמש בשילוב של פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ומודלים של בעלי חיים in vivo . צעד קריטי היה הקמתה של רשת "תרופה-רכיב-מטרה", שהייתה חיונית לזיהוי המנגנונים הפוטנציאליים של JWSJS בטיפול בדנ"ן, והתמקדה במיוחד באינטראקציה שלה עם מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F