糖尿病性腎症のラットモデルに対するJiawei Shengjiang Sanの拮抗効果:EGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路との関連

Summary

ここでは、糖尿病性腎症の治療におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用機序を探求するためのネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を説明するプロトコルを紹介します。

Abstract

私たちは、糖尿病性腎症の治療とネットワーク薬理学の展開におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用を支えるメカニズムを掘り下げることを目指しました。ネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を用いて、JWSJSの活性成分と標的を予測し、緻密な「薬物-成分-標的」ネットワークを構築しました。Gene Ontology(GO)とKyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)のエンリッチメント解析を利用して、JWSJSの治療経路と標的を特定しました。分子ドッキング検証のためにAutodock Vina 1.2.0をデプロイし、ドッキング結果を確認するために100nsの分子動力学シミュレーションを実施し、続いて in vivo 動物検証を行いました。その結果、JWSJSは糖尿病性腎症と227の交差する標的を共有し、タンパク質間相互作用ネットワークトポロジーを構築していることが明らかになった。KEGGの濃縮解析では、JWSJSは、脂質とアテローム性動脈硬化症、PI3K-Aktシグナル伝達経路、アポトーシス、HIF-1シグナル伝達経路を調節することにより、糖尿病性腎症を緩和し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ1(MAPK1)、MAPK3、上皮成長因子受容体(EGFR)、およびセリン/スレオニンプロテインキナーゼ1(AKT1)を複数の経路の集合的標的として同定したことが示されました。分子ドッキングは、JWSJSのコア成分(ケルセチン、パルミトレイン酸、ルテオリン)が水素結合を通じて3つの重要なターゲット(MAPK1、MAPK3、EGFR)とのコンフォメーションを安定させることができると主張しました。 In vivo 試験では、JWSJSによる体重の顕著な増加と、糖化血清タンパク質(GSP)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、ウリジン三リン酸(UTP)、空腹時血糖値(FBG)の低下が示されました。ヘマトキシリンとエオシン(HE)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色と組み合わせた電子顕微鏡法は、p-EGFR、p-MAPK3/1、およびBAXのさまざまな減少を示し、治療されたラットの腎臓組織におけるBCL-2発現の増加を示す、さまざまな程度の腎臓障害を軽減する各治療群の可能性を強調しました。結論として、これらの洞察は、糖尿病性腎症に対するJWSJSの保護効果が、EGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路の活性化の抑制と腎細胞アポトーシスの緩和に関連している可能性があることを示唆しています。

Introduction

糖尿病(DM)は、糖尿病性腎症(DN)、網膜症、神経障害など、複数のシステムに影響を及ぼし、継続的な高血糖によるさまざまな合併症を引き起こす可能性のある慢性疾患^です1。DNはDMの重篤な合併症であり、末期腎疾患(ESRD)の約30%〜50%を占めています²。その臨床症状は微量アルブミン尿症であり、糸球体容積の増加、中双眼間質過形成、および肥厚した糸球体基底膜を特徴とするESRDに進行する可能性があります³。DNの病因は複雑で、完全には解明されていません。血糖値を下げる、血圧を調節する、タンパク尿を減らすなどの臨床方法は、主にその進行を遅らせるために使用されますが、その効果は一般的です。

現在、DN⁴を治療する特定の薬剤は見つかっていません。しかし、何世紀にもわたって、漢方薬は糖尿病とその合併症の治療に広く使用^{されており5、} 患者の臨床症状を改善し、疾患の進行を遅らせてきました。多成分、多標的、および多経路効果の利点により、漢方薬は^DN6の治療のための革新的な薬物源になると期待されています。

Protocol

すべての動物は、米国国立研究評議会実験動物の世話と使用に関するガイド、第^{8版に従って}維持および使用され、ARRIVEガイドライン^16,17で推奨されているように報告されました。この研究は、China National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(中国国家研究評議会実験動物の世話と使用に関するガイド)に従って実施され、河北中医薬大学(DWLL2019030)の動物倫理委員会によって承認されました。

1. JWSJS有効成分とターゲットコレクション

1. 薬用組成物JWSJS(Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba、Smilacis Glabrae Rhixoma、Radix Rhei et Rhizome、およびCurcumaelongae Rhizoma)を伝統的な漢方薬システム薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP)データベース

Discussion

私たちの研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、および in vivo 動物モデルの組み合わせを採用しました。重要なステップは、「薬物-成分-標的」ネットワークの確立であり、これはDNの治療におけるJWSJSの潜在的なメカニズムを特定するために重要であり、特にEGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路との相互作用に焦点を当てていました。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F