당뇨병성 신병증의 쥐 모델에 대한 Jiawei Shengjiang San의 길항 효과: EGFR/MAPK3/1 신호 경로와 관련

Summary

여기에서는 당뇨병성 신병증 치료에서 Jiawei Shengjiang San(JWSJS)의 작용 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학 및 분자 도킹 기술을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

우리는 당뇨병성 신증을 치료하고 네트워크 약리학을 배포하기 위한 Jiawei Shengjiang San(JWSJS)의 조치를 뒷받침하는 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 네트워크 약리학 및 분자 도킹 기법을 사용하여 JWSJS의 활성 성분과 표적을 예측하고 세심한 "약물-성분-표적" 네트워크를 구축했습니다. 유전자 온톨로지(Gene ontology, GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 농축 분석을 활용하여 JWSJS의 치료 경로와 표적을 식별했습니다. 분자 도킹 검증을 위해 Autodock Vina 1.2.0을 배포하고, 도킹 결과를 확인하기 위해 100ns의 분자 역학 시뮬레이션을 수행한 후 in vivo 동물 검증을 수행했습니다. 그 결과, JWSJS는 당뇨병성 신증과 교차하는 227개의 표적을 공유하여 단백질-단백질 상호작용 네트워크 토폴로지를 구축한 것으로 밝혀졌습니다. KEGG 농축 분석은 JWSJS가 지질 및 죽상동맥경화증, PI3K-Akt 신호전달 경로, 세포사멸 및 HIF-1 신호전달 경로를 조절하여 당뇨병성 신병증을 완화하며, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 1(MAPK1), MAPK3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 1(AKT1)을 여러 경로의 집합적 표적으로 식별함으로써 당뇨병성 신병증을 완화하는 것으로 나타났습니다. 분자 도킹은 JWSJS의 핵심 구성 요소(퀘르세틴, 팔미톨레산, 루테올린)가 수소 결합을 통해 세 가지 핵심 대상(MAPK1, MAPK3 및 EGFR)과의 형태를 안정화할 수 있다고 주장했습니다. 생체 내 검사에서 JWSJS로 인한 체중 증가와 당혈청 단백질(GSP), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C), 우리딘 삼인산(UTP) 및 공복 혈당(FBG) 수치의 감소가 눈에 띄게 나타났습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 주기적 산-쉬프(PAS) 염색과 결합된 전자 현미경은 p-EGFR, p-MAPK3/1 및 BAX의 다양한 감소와 치료된 쥐의 신장 조직에서 BCL-2 발현의 증가를 나타내며 다양한 범위로 신장 손상을 완화하는 데 있어 각 치료군의 잠재력을 강조했습니다. 결론적으로, 이러한 통찰은 당뇨병성 신증에 대한 JWSJS의 보호 효능이 EGFR/MAPK3/1 신호전달 경로의 활성화를 억제하고 신장 세포 사멸을 완화하는 것과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

Introduction

당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 여러 시스템에 영향을 미치는 만성 질환으로, 당뇨병성 신증(DN), 망막병증, 신경병증 등 지속적인 고혈당증으로 인해 다양한 합병증을 유발할 수 있다¹. DN은 말기 신장 질환(ESRD)의 약 30%-50%를 차지하는 DM의 심각한 합병증입니다². 임상적 증상은 미세알부민뇨증으로, 사구체 부피 증가, 간막 기질 증식, 두꺼워진 사구체 기저막 등을 특징으로 하는 ESRD로 진행될 수 있다³. DN의 발병 기전은 복잡하며 완전히 밝혀지지 않았습니다. 혈당을 낮추고, 혈압을 조절하고, 단백뇨를 줄이는 등의 임상적 방법이 주로 진행을 지연시키는 데 사용되지만 효과는 일반적입니다.

현재로서는 DN⁴를 치료하는 특정 약물이 발견되지 않았습니다. 그러나 수 세기 동안 한약은 당뇨병과 그 합병증을 치료하는 데 널리 사용되어 왔으며5 환자의 임상 증상을 개선하고 질병 진행을 지연시켰다. multi-component, multi-targe....

Protocol

모든 동물은 미국 국립 연구 위원회(US National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 지침(US National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,^8th Edition)에 따라 유지 및 사용되었으며, ARRIVE 가이드라인^16,17에서 권장하는 대로 보고되었습니다. 이 연구는 중국 국가연구위원회(China National Research Council)의 실험동물 ?.......

Discussion

우리의 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹 및 생체 내 동물 모델의 조합을 사용했습니다. 중요한 단계는 "약물-성분-표적" 네트워크의 구축이었으며, 이는 특히 EGFR/MAPK3/1 신호 경로와의 상호 작용에 중점을 두고 DN 치료에서 JWSJS의 잠재적 메커니즘을 식별하는 데 중요했습니다.

이 연구에서 우리는 예측의 정확도를 높이기 위해 특히 분자 도킹.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F