Efeito antagônico de Jiawei Shengjiang San em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a farmacologia da rede e as técnicas de docking molecular para explorar o mecanismo de ação do Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética.

Abstract

Nosso objetivo foi aprofundar os mecanismos subjacentes à ação de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética e na implantação da farmacologia em rede. Empregando farmacologia de rede e técnicas de docking molecular, previmos os componentes ativos e alvos do JWSJS e construímos uma rede meticulosa de "medicamento-componente-alvo". As análises de enriquecimento da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG) foram utilizadas para discernir as vias terapêuticas e os alvos do JWSJS. O Autodock Vina 1.2.0 foi implantado para verificação de docking molecular, e uma simulação de dinâmica molecular de 100 ns foi conduzida para confirmar os resultados do docking, seguida de verificação in vivo em animais. Os resultados revelaram que o JWSJS compartilhava 227 alvos que se cruzavam com a nefropatia diabética, construindo uma topologia de rede de interação proteína-proteína. A análise de enriquecimento de KEGG denotou que o JWSJS mitiga a nefropatia diabética modulando lipídios e aterosclerose, a via de sinalização PI3K-Akt, apoptose e a via de sinalização HIF-1, com proteína quinase 1 ativada por mitógeno (MAPK1), MAPK3, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e serina/treonina-proteína quinase 1 (AKT1) identificados como alvos coletivos de múltiplas vias. O docking molecular afirmou que os principais componentes do JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico e luteolina) poderiam estabilizar a conformação com três alvos principais (MAPK1, MAPK3 e EGFR) por meio de ligações de hidrogênio. Exames in vivo indicaram aumento notável no peso corporal e reduções nos níveis de proteína sérica glicada (GSP), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), trifosfato de uridina (UTP) e glicemia de jejum (FBG) devido à JWSJS. A microscopia eletrônica acoplada à coloração de hematoxilina e eosina (HE) e ácido periódico-Schiff (PAS) destacou o potencial de cada grupo de tratamento em aliviar danos renais em diversas extensões, exibindo declínios variados em p-EGFR, p-MAPK3 / 1 e BAX, e incrementos na expressão de BCL-2 nos tecidos renais dos ratos tratados. Conclusivamente, esses insights sugerem que a eficácia protetora da JWSJS na nefropatia diabética pode estar associada à supressão da ativação da via de sinalização EGFR/MAPK3/1 e ao alívio da apoptose das células renais.

Introduction

O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica que acomete múltiplos sistemas e pode causar diversas complicações devido à hiperglicemia contínua, como nefropatia diabética (ND), retinopatia e neuropatia¹. A ND é uma complicação grave do DM, sendo responsável por cerca de 30% a 50% da doença renal terminal (DRT)². Sua manifestação clínica é a microalbuminúria, que pode evoluir para DRCT caracterizada por aumento do volume glomerular, hiperplasia estromal mesangial e espessamento da membrana basal glomerular³. A patogênese da ND é complexa e não foi totalmente eluci....

Protocol

Todos os animais foram mantidos e utilizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório,^8ª Edição, e foram relatados conforme recomendado nas diretrizes ARRIVE^16,17. O estudo foi conduzido de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa da China para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Univ.......

Discussion

Nosso estudo empregou uma combinação de farmacologia de rede, docking molecular e modelos animais in vivo . Um passo crítico foi o estabelecimento da rede "medicamento-componente-alvo", que foi crucial para identificar os mecanismos potenciais do JWSJS no tratamento da ND, concentrando-se particularmente em sua interação com a via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1.

Durante este estudo, fizemos várias modificações, particularmente no processo d.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F