Antagonistisk effekt av Jiawei Shengjiang San på en råttmodell av diabetisk nefropati: relaterad till EGFR/MAPK3/1 signalväg

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver nätverksfarmakologi och molekylära dockningstekniker för att utforska verkningsmekanismen för Jiawei Shengjiang San (JWSJS) vid behandling av diabetisk nefropati.

Abstract

Vårt mål var att fördjupa oss i de mekanismer som ligger till grund för Jiawei Shengjiang Sans (JWSJS) åtgärder vid behandling av diabetesnefropati och användning av nätverksfarmakologi. Med hjälp av nätverksfarmakologi och molekylära dockningstekniker förutspådde vi de aktiva komponenterna och målen för JWSJS och konstruerade ett noggrant "drug-component-target"-nätverk. Analyser av genontologi (GO) och Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) användes för att urskilja de terapeutiska vägarna och målen för JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 användes för molekylär dockningsverifiering, och en 100-ns molekyldynamiksimulering utfördes för att bekräfta dockningsresultaten, följt av in vivo djurverifiering. Resultaten avslöjade att JWSJS delade 227 korsande mål med diabetisk nefropati, vilket konstruerade en topologi för protein-proteininteraktion. KEGG-anrikningsanalys betecknade att JWSJS mildrar diabetisk nefropati genom att modulera lipider och ateroskleros, PI3K-Akt-signalvägen, apoptos och HIF-1-signalvägen, med mitogenaktiverat proteinkinas 1 (MAPK1), MAPK3, epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och serin/treonin-proteinkinas 1 (AKT1) identifierade som kollektiva mål för flera vägar. Molekylär dockning hävdade att kärnkomponenterna i JWSJS (quercetin, palmitoleinsyra och luteolin) kunde stabilisera konformationen med tre pivotala mål (MAPK1, MAPK3 och EGFR) genom vätebindning. In vivo-undersökningar indikerade en märkbar ökning av kroppsvikt och minskningar av glykerat serumprotein (GSP), lipoproteinkolesterol med låg densitet (LDL-C), uridintrifosfat (UTP) och fasteblodsocker (FBG) nivåer på grund av JWSJS. Elektronmikroskopi i kombination med hematoxylin och eosin (HE) och periodisk syra-Schiff (PAS) färgning belyste potentialen hos varje behandlingsgrupp för att lindra njurskador i olika utsträckning, och uppvisade varierande minskningar av p-EGFR, p-MAPK3/1 och BAX, och ökningar av BCL-2-uttryck i njurvävnaden hos de behandlade råttorna. Sammanfattningsvis tyder dessa insikter på att den skyddande effekten av JWSJS på diabetisk nefropati kan vara förknippad med undertryckande av aktiveringen av EGFR/MAPK3/1-signalvägen och lindring av njurcellsapoptos.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) är en kronisk sjukdom som påverkar flera system och kan orsaka olika komplikationer på grund av kontinuerlig hyperglykemi, såsom diabetisk nefropati (DN), retinopati och neuropati¹. DN är en allvarlig komplikation av DM och står för cirka 30–50 % av njursvikt i slutstadiet (ESRD)². Dess kliniska manifestation är mikroalbuminuri, som kan utvecklas till ESRD och kännetecknas av ökad glomerulär volym, mesangial stromal hyperplasi och förtjockat glomerulärt basalmembran³. Patogenesen av DN är komplex och har inte blivit helt klarlagd. Kliniska m....

Protocol

Alla djur sköttes och användes i enlighet med US National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8:^e upplagan, och rapporterades enligt rekommendationerna i ARRIVE-riktlinjerna^16,17. Studien genomfördes i enlighet med China National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Animal Ethics Committee vid Hebei University of Chinese Medicine (DWLL2019.......

Discussion

I vår studie använde vi oss av en kombination av nätverksfarmakologi, molekylär dockning och in vivo djurmodeller. Ett kritiskt steg var etableringen av nätverket "drug-component-target", som var avgörande för att identifiera de potentiella mekanismerna för JWSJS vid behandling av DN, med särskilt fokus på dess interaktion med EGFR/MAPK3/1-signalvägen.

Under denna studie gjorde vi flera modifieringar, särskilt i den molekylära dockningspr.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F