Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34+ (CD34+ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.

Abstract

תאי גזע ותאי אב תושבי CD34+ שוכנים בדופן כלי הדם (VW-SCs) מוכרים יותר ויותר בזכות תפקידם המכריע בוויסות פגיעה ותיקון כלי דם. הקמת שיטה יציבה ויעילה לתרבית תפקודית של תאים מסוג CD34+ VW-SCs חיונית להמשך חקירת המנגנונים המעורבים בהתפשטות, נדידה והתמיינות של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. השיטה המתוארת משלבת סינון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה לטיהור תושבות ראשוניות CD34+ פולקסווגן SC. התאים המטוהרים מזוהים לאחר מכן באופן פונקציונלי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיית Ca2+ . בקצרה, תאים וסקולריים מן adventitia של אבי העורקים murine ועורק mesenteric מתקבלים באמצעות חיבור בלוק רקמות, ואחריו subculturing עד להגיע לספירת תאים של לפחות 1 × 107. לאחר מכן, CD34+ VW-SCs מטוהרים באמצעות מיון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה. זיהוי של CD34+ VW-SCs כרוך בצביעת אימונופלואורסצנטיות תאית, בעוד שריבוי עוצמה תפקודית נקבעת על ידי חשיפת תאים למדיום תרבית ספציפי לצורך התמיינות מכוונת. יתר על כן, שחרור Ca2+ פנימי פונקציונלי וכניסת Ca2+ חיצונית מוערכים באמצעות תחנת עבודה הדמיה זמינה מסחרית בתאים עמוסי Fura-2/AM שנחשפו ל- ATP, קפאין או תפסיגרגין (TG). שיטה זו מציעה טכניקה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וזיהוי תאי גזע CD34+ השוכנים בדופן כלי הדם, ומספקת הזדמנות למחקרי מבחנה על מנגנוני הבקרה של VW-SCs וסינון תרופות ממוקדות.

Introduction

דופן כלי הדם ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות כלי הדם, בוויסות ההומיאוסטטי ובהתקדמות מחלות כלי הדם. בשנים האחרונות, מחקרים רבים חשפו את נוכחותן של שושלות תאי גזע שונות בעורקים. בשנת 2004, קבוצתו של פרופסור צ'ינגבו שו דיווחה לראשונה על קיומם של תאי גזע / אב וסקולריים בפריפריה של דופן כלי הדם הבוגרים, המבטאים CD34, Sca-1, c-kit ו- Flk-11. תאי גזע וסקולריים אלה מפגינים התמיינות רב-כיוונית ופוטנציאל התפשטות. בתנאים רגילים, הם נשארים שקטים יחסית; עם זאת, כאשר הם מופעלים על ידי גורמים ספציפיים, הם יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, תאי אנדותל ופיברובלסטים. לחלופין, הם יכולים לווסת את המטריצה perivascular ואת היווצרות microvessel באמצעות אפקטים paracrine כדי לקד....

Protocol

מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU2020664). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בריאים בני שמונה שבועות משני המינים, במשקל שבין 18-20 גרם. בעלי החיים ש?.......

Representative Results

בידוד וטיהור של CD34+ VW-SCs
טוהר גבוה של CD34+ VW-SCs מתקבל מן adventitia של העכבר אבי העורקים עורק mesenteric על ידי חיבור רקמות ומיון microbead מגנטי. אחוז תאי CD34+ בדופן כלי הדם הוא בדרך כלל 10%-30%. ציטומטריית זרימה מאשרת שהטוהר של תאי CD34+ המתקבל על-ידי מיון חרוזים מגנטי הוא יותר מ-90.......

Discussion

מחקר זה מספק שיטה מהירה ונוחה להשגת CD34+ פולקסווגן SCs פונקציונליים מאבי העורקים והעורקים המזנטריים של עכברים. CD34+ פולקסווגן SC המתקבלים בשיטה זו הם בעלי פעילות שגשוג ותכונות בידול רב-כיווניות. קולטני טריפוספט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP3Rs), קולטני ריאנודין (RyRs) ותעלות סידן המופע.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82070502, 31972909, 32171099), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן של מחוז סצ'ואן (23NSFSC0576, 2022YFS0607). המחברים רוצים להודות לצ'ינגבו שו מאוניברסיטת ג'ג'יאנג על העזרה בתרבית התא, והמחברים מודים על הסיוע המדעי והטכני של פלטפורמת ציטומטריית הזרימה באוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2% gelatin solutionSigmaG1393
Anti-CD31 antibodyR&DAF3628
Anti-CD34 antibodyAbcamab81289
Anti-c-kit antibodyCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 antibodyAbcamab24313
Anti-Ki67 antibodyCST34330
Anti-PDGFRα antibodyAbcamab131591
Anti-Sca- 1 antibodyInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITCeBioscience  Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
cell culture hoodJIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
Centrifuge  CENCE  L530
CO2 incubators            Thermofisher Scientific4111
Confocal laser scanning microscope Zeiss zeiss 980  
DMEM High Glucose MediumATCC30-2002
EBM-2 culture mediumLonzaCC-3162
FACSMelody  BD Biosciences
FACSMelody™ System BD
Fetal bovine serumMilliporeES-009-C
FM-2 culture mediumScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermofisher Scientific   A32731
Leukemia inhibitory factorMilliporeLIF2010
Microscope OlympusIX71
MiniMACS   Starting KitMiltenyi Biotec130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionBeyotimeC0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141
Stereo Microscope OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 program  T.I.L.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)Thermofisher Scientific MA5-14029
β-MercaptoethanolThermofisher Scientific21985023

References

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CD34Ca2ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved