בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

Summary

מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34⁺ (CD34⁺ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.

Abstract

תאי גזע ותאי אב תושבי CD34⁺ שוכנים בדופן כלי הדם (VW-SCs) מוכרים יותר ויותר בזכות תפקידם המכריע בוויסות פגיעה ותיקון כלי דם. הקמת שיטה יציבה ויעילה לתרבית תפקודית של תאים מסוג CD34⁺ VW-SCs חיונית להמשך חקירת המנגנונים המעורבים בהתפשטות, נדידה והתמיינות של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. השיטה המתוארת משלבת סינון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה לטיהור תושבות ראשוניות CD34⁺ פולקסווגן SC. התאים המטוהרים מזוהים לאחר מכן באופן פונקציונלי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיית Ca²⁺ . בקצרה, תאים וסקולריים מן adventitia של אבי העורקים murine ועורק mesenteric מתקבלים באמצעות חיבור בלוק רקמות, ואחריו subculturing עד להגיע לספירת תאים של לפחות 1 × 10⁷. לאחר מכן, CD34⁺ VW-SCs מטוהרים באמצעות מיון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה. זיהוי של CD34⁺ VW-SCs כרוך בצביעת אימונופלואורסצנטיות תאית, בעוד שריבוי עוצמה תפקודית נקבעת על ידי חשיפת תאים למדיום תרבית ספציפי לצורך התמיינות מכוונת. יתר על כן, שחרור Ca²⁺ פנימי פונקציונלי וכניסת Ca²⁺ חיצונית מוערכים באמצעות תחנת עבודה הדמיה זמינה מסחרית בתאים עמוסי Fura-2/AM שנחשפו ל- ATP, קפאין או תפסיגרגין (TG). שיטה זו מציעה טכניקה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וזיהוי תאי גזע CD34⁺ השוכנים בדופן כלי הדם, ומספקת הזדמנות למחקרי מבחנה על מנגנוני הבקרה של VW-SCs וסינון תרופות ממוקדות.

Introduction

דופן כלי הדם ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות כלי הדם, בוויסות ההומיאוסטטי ובהתקדמות מחלות כלי הדם. בשנים האחרונות, מחקרים רבים חשפו את נוכחותן של שושלות תאי גזע שונות בעורקים. בשנת 2004, קבוצתו של פרופסור צ'ינגבו שו דיווחה לראשונה על קיומם של תאי גזע / אב וסקולריים בפריפריה של דופן כלי הדם הבוגרים, המבטאים CD34, Sca-1, c-kit ו- Flk-1¹. תאי גזע וסקולריים אלה מפגינים התמיינות רב-כיוונית ופוטנציאל התפשטות. בתנאים רגילים, הם נשארים שקטים יחסית; עם זאת, כאשר הם מופעלים על ידי גורמים ספציפיים, הם יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, תאי אנדותל ופיברובלסטים. לחלופין, הם יכולים לווסת את המטריצה perivascular ואת היווצרות microvessel באמצעות אפקטים paracrine כדי לקד....

Protocol

מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU2020664). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בריאים בני שמונה שבועות משני המינים, במשקל שבין 18-20 גרם. בעלי החיים ש?.......

Discussion

מחקר זה מספק שיטה מהירה ונוחה להשגת CD34⁺ פולקסווגן SCs פונקציונליים מאבי העורקים והעורקים המזנטריים של עכברים. CD34⁺ פולקסווגן SC המתקבלים בשיטה זו הם בעלי פעילות שגשוג ותכונות בידול רב-כיווניות. קולטני טריפוספט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP₃Rs), קולטני ריאנודין (RyRs) ותעלות סידן המופע.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023