A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34+ (CD34+ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.
תאי גזע ותאי אב תושבי CD34+ שוכנים בדופן כלי הדם (VW-SCs) מוכרים יותר ויותר בזכות תפקידם המכריע בוויסות פגיעה ותיקון כלי דם. הקמת שיטה יציבה ויעילה לתרבית תפקודית של תאים מסוג CD34+ VW-SCs חיונית להמשך חקירת המנגנונים המעורבים בהתפשטות, נדידה והתמיינות של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. השיטה המתוארת משלבת סינון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה לטיהור תושבות ראשוניות CD34+ פולקסווגן SC. התאים המטוהרים מזוהים לאחר מכן באופן פונקציונלי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיית Ca2+ . בקצרה, תאים וסקולריים מן adventitia של אבי העורקים murine ועורק mesenteric מתקבלים באמצעות חיבור בלוק רקמות, ואחריו subculturing עד להגיע לספירת תאים של לפחות 1 × 107. לאחר מכן, CD34+ VW-SCs מטוהרים באמצעות מיון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה. זיהוי של CD34+ VW-SCs כרוך בצביעת אימונופלואורסצנטיות תאית, בעוד שריבוי עוצמה תפקודית נקבעת על ידי חשיפת תאים למדיום תרבית ספציפי לצורך התמיינות מכוונת. יתר על כן, שחרור Ca2+ פנימי פונקציונלי וכניסת Ca2+ חיצונית מוערכים באמצעות תחנת עבודה הדמיה זמינה מסחרית בתאים עמוסי Fura-2/AM שנחשפו ל- ATP, קפאין או תפסיגרגין (TG). שיטה זו מציעה טכניקה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וזיהוי תאי גזע CD34+ השוכנים בדופן כלי הדם, ומספקת הזדמנות למחקרי מבחנה על מנגנוני הבקרה של VW-SCs וסינון תרופות ממוקדות.
דופן כלי הדם ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות כלי הדם, בוויסות ההומיאוסטטי ובהתקדמות מחלות כלי הדם. בשנים האחרונות, מחקרים רבים חשפו את נוכחותן של שושלות תאי גזע שונות בעורקים. בשנת 2004, קבוצתו של פרופסור צ'ינגבו שו דיווחה לראשונה על קיומם של תאי גזע / אב וסקולריים בפריפריה של דופן כלי הדם הבוגרים, המבטאים CD34, Sca-1, c-kit ו- Flk-11. תאי גזע וסקולריים אלה מפגינים התמיינות רב-כיוונית ופוטנציאל התפשטות. בתנאים רגילים, הם נשארים שקטים יחסית; עם זאת, כאשר הם מופעלים על ידי גורמים ספציפיים, הם יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, תאי אנדותל ופיברובלסטים. לחלופין, הם יכולים לווסת את המטריצה perivascular ואת היווצרות microvessel באמצעות אפקטים paracrine כדי לקד....
מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU2020664). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בריאים בני שמונה שבועות משני המינים, במשקל שבין 18-20 גרם. בעלי החיים ש?.......
בידוד וטיהור של CD34+ VW-SCs
טוהר גבוה של CD34+ VW-SCs מתקבל מן adventitia של העכבר אבי העורקים עורק mesenteric על ידי חיבור רקמות ומיון microbead מגנטי. אחוז תאי CD34+ בדופן כלי הדם הוא בדרך כלל 10%-30%. ציטומטריית זרימה מאשרת שהטוהר של תאי CD34+ המתקבל על-ידי מיון חרוזים מגנטי הוא יותר מ-90.......
מחקר זה מספק שיטה מהירה ונוחה להשגת CD34+ פולקסווגן SCs פונקציונליים מאבי העורקים והעורקים המזנטריים של עכברים. CD34+ פולקסווגן SC המתקבלים בשיטה זו הם בעלי פעילות שגשוג ותכונות בידול רב-כיווניות. קולטני טריפוספט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP3Rs), קולטני ריאנודין (RyRs) ותעלות סידן המופע.......
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82070502, 31972909, 32171099), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן של מחוז סצ'ואן (23NSFSC0576, 2022YFS0607). המחברים רוצים להודות לצ'ינגבו שו מאוניברסיטת ג'ג'יאנג על העזרה בתרבית התא, והמחברים מודים על הסיוע המדעי והטכני של פלטפורמת ציטומטריית הזרימה באוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2% gelatin solution | Sigma | G1393 | |
Anti-CD31 antibody | R&D | AF3628 | |
Anti-CD34 antibody | Abcam | ab81289 | |
Anti-c-kit antibody | CST | 77522 | |
Anti-FITC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-FITC MicroBeads MACS | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-Flk- 1 antibody | Abcam | ab24313 | |
Anti-Ki67 antibody | CST | 34330 | |
Anti-PDGFRα antibody | Abcam | ab131591 | |
Anti-Sca- 1 antibody | Invitrogen | 710952 | |
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC | eBioscience Invitrogen | 11-1401-82 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC | eBioscience Invitrogen | 17-0311-82 | |
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 | Miltenyi Biotec | 130-117-775 | |
cell culture hood | JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD | SW-CJ-2FD | |
Centrifuge | CENCE | L530 | |
CO2 incubators | Thermofisher Scientific | 4111 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | zeiss 980 | |
DMEM High Glucose Medium | ATCC | 30-2002 | |
EBM-2 culture medium | Lonza | CC-3162 | |
FACSMelody | BD Biosciences | ||
FACSMelody™ System | BD | ||
Fetal bovine serum | Millipore | ES-009-C | |
FM-2 culture medium | ScienCell | 2331 | |
Fura-2/AM | Invitrogen | M1292 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermofisher Scientific | A32731 | |
Leukemia inhibitory factor | Millipore | LIF2010 | |
Microscope | Olympus | IX71 | |
MiniMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-312 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Beyotime | C0224 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | |
TILLvisION 4.0 program | T.I.L.L.Photonics GmbH | polychrome V | |
VWF Monoclonal Antibody (F8/86) | Thermofisher Scientific | MA5-14029 | |
β-Mercaptoethanol | Thermofisher Scientific | 21985023 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved