Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Summary

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular (CD34⁺ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Abstract

As células-tronco e progenitoras residentes na parede vascular CD34⁺ residentes (VW-SCs) são cada vez mais reconhecidas por seu papel crucial na regulação da lesão e reparo vascular. Estabelecer um método estável e eficiente para cultivar VW-SCs CD34⁺ murinos funcionais é essencial para investigar ainda mais os mecanismos envolvidos na proliferação, migração e diferenciação dessas células sob várias condições fisiológicas e patológicas. O método descrito combina triagem de esferas magnéticas e citometria de fluxo para purificar VW-SCs CD34⁺ residentes em cultura primária. As células purificadas são então identificadas funcionalmente por meio de coloração por imunofluorescência e imagem de Ca²⁺ . Resumidamente, as células vasculares da adventícia da aorta murina e da artéria mesentérica são obtidas por meio da fixação de blocos teciduais, seguida de subcultura até atingir uma contagem de células de pelo menos 1 × 10⁷. Posteriormente, os VW-SCs CD34⁺ são purificados usando classificação magnética de esferas e citometria de fluxo. A identificação de VW-SCs CD34⁺ envolve a coloração por imunofluorescência celular, enquanto a multipotência funcional é determinada pela exposição das células a um meio de cultura específico para diferenciação orientada. Além disso, a liberação funcional interna de Ca²⁺ e a entrada externa de Ca²⁺ são avaliadas usando uma estação de trabalho de imagem disponível comercialmente em células carregadas com Fura-2 / AM expostas a ATP, cafeína ou tapsigargina (TG). Este método oferece uma técnica estável e eficiente para isolar, cultivar e identificar células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular, proporcionando uma oportunidade para estudos in vitro sobre os mecanismos regulatórios de VW-SCs e a triagem de medicamentos direcionados.

Introduction

A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fat....

Protocol

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medi.......

Discussion

Este estudo fornece um método rápido e conveniente para a obtenção de VW-SCs CD34⁺ funcionais da aorta e artérias mesentéricas de camundongos. Os VW-SCs CD34⁺ obtidos por este método têm atividade proliferativa e propriedades de diferenciação multidirecional. Os receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP₃Rs), os receptores de rianodina (RyRs) e os canais de cálcio operados por armazenamento medeiam a liberação e entrada de Ca²⁺ em VW-SCs CD34⁺

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023