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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Abstract

As células-tronco e progenitoras residentes na parede vascular CD34+ residentes (VW-SCs) são cada vez mais reconhecidas por seu papel crucial na regulação da lesão e reparo vascular. Estabelecer um método estável e eficiente para cultivar VW-SCs CD34+ murinos funcionais é essencial para investigar ainda mais os mecanismos envolvidos na proliferação, migração e diferenciação dessas células sob várias condições fisiológicas e patológicas. O método descrito combina triagem de esferas magnéticas e citometria de fluxo para purificar VW-SCs CD34+ residentes em cultura primária. As células purificadas são então identificadas funcionalmente por meio de coloração por imunofluorescência e imagem de Ca2+ . Resumidamente, as células vasculares da adventícia da aorta murina e da artéria mesentérica são obtidas por meio da fixação de blocos teciduais, seguida de subcultura até atingir uma contagem de células de pelo menos 1 × 107. Posteriormente, os VW-SCs CD34+ são purificados usando classificação magnética de esferas e citometria de fluxo. A identificação de VW-SCs CD34+ envolve a coloração por imunofluorescência celular, enquanto a multipotência funcional é determinada pela exposição das células a um meio de cultura específico para diferenciação orientada. Além disso, a liberação funcional interna de Ca2+ e a entrada externa de Ca2+ são avaliadas usando uma estação de trabalho de imagem disponível comercialmente em células carregadas com Fura-2 / AM expostas a ATP, cafeína ou tapsigargina (TG). Este método oferece uma técnica estável e eficiente para isolar, cultivar e identificar células-tronco CD34+ residentes na parede vascular, proporcionando uma oportunidade para estudos in vitro sobre os mecanismos regulatórios de VW-SCs e a triagem de medicamentos direcionados.

Introduction

A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-11. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fat....

Protocol

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medi.......

Representative Results

Isolamento e purificação de CD34+ VW-SCs
A alta pureza dos VW-SCs CD34+ é obtida a partir da adventícia da artéria aórtica e mesentérica de camundongo por fixação tecidual e classificação de microesferas magnéticas. A porcentagem de células CD34+ na parede do vaso é geralmente de 10% a 30%. A citometria de fluxo confirma que a pureza das células CD34+ obtidas por classificação magnética de esferas é superior a 90% (Fig.......

Discussion

Este estudo fornece um método rápido e conveniente para a obtenção de VW-SCs CD34+ funcionais da aorta e artérias mesentéricas de camundongos. Os VW-SCs CD34+ obtidos por este método têm atividade proliferativa e propriedades de diferenciação multidirecional. Os receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs), os receptores de rianodina (RyRs) e os canais de cálcio operados por armazenamento medeiam a liberação e entrada de Ca2+ em VW-SCs CD34+

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82070502, 31972909, 32171099), do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan da Província de Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Os autores gostariam de agradecer a Qingbo Xu, da Universidade de Zhejiang, pela ajuda com a cultura de células, e os autores reconhecem a assistência científica e técnica da plataforma de citometria de fluxo na Southwest Medical University.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2% gelatin solutionSigmaG1393
Anti-CD31 antibodyR&DAF3628
Anti-CD34 antibodyAbcamab81289
Anti-c-kit antibodyCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 antibodyAbcamab24313
Anti-Ki67 antibodyCST34330
Anti-PDGFRα antibodyAbcamab131591
Anti-Sca- 1 antibodyInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITCeBioscience  Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
cell culture hoodJIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
Centrifuge  CENCE  L530
CO2 incubators            Thermofisher Scientific4111
Confocal laser scanning microscope Zeiss zeiss 980  
DMEM High Glucose MediumATCC30-2002
EBM-2 culture mediumLonzaCC-3162
FACSMelody  BD Biosciences
FACSMelody™ System BD
Fetal bovine serumMilliporeES-009-C
FM-2 culture mediumScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermofisher Scientific   A32731
Leukemia inhibitory factorMilliporeLIF2010
Microscope OlympusIX71
MiniMACS   Starting KitMiltenyi Biotec130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionBeyotimeC0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141
Stereo Microscope OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 program  T.I.L.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)Thermofisher Scientific MA5-14029
β-MercaptoethanolThermofisher Scientific21985023

References

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al.

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Palavras chave Isolamento Imunomagn ticoC lulas Tronco CD34 Residentes na Parede VascularPurifica oCitometria de FluxoIdentifica o FuncionalColora o por Imunofluoresc nciaImagem de Ca2Aorta Murina e Art ria Mesent ricaAdvent ciaCultura de C lulasMultipot nciaDiferencia oATPCafe naThapsigargin

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