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Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.
As células-tronco e progenitoras residentes na parede vascular CD34+ residentes (VW-SCs) são cada vez mais reconhecidas por seu papel crucial na regulação da lesão e reparo vascular. Estabelecer um método estável e eficiente para cultivar VW-SCs CD34+ murinos funcionais é essencial para investigar ainda mais os mecanismos envolvidos na proliferação, migração e diferenciação dessas células sob várias condições fisiológicas e patológicas. O método descrito combina triagem de esferas magnéticas e citometria de fluxo para purificar VW-SCs CD34+ residentes em cultura primária. As células purificadas são então identificadas funcionalmente por meio de coloração por imunofluorescência e imagem de Ca2+ . Resumidamente, as células vasculares da adventícia da aorta murina e da artéria mesentérica são obtidas por meio da fixação de blocos teciduais, seguida de subcultura até atingir uma contagem de células de pelo menos 1 × 107. Posteriormente, os VW-SCs CD34+ são purificados usando classificação magnética de esferas e citometria de fluxo. A identificação de VW-SCs CD34+ envolve a coloração por imunofluorescência celular, enquanto a multipotência funcional é determinada pela exposição das células a um meio de cultura específico para diferenciação orientada. Além disso, a liberação funcional interna de Ca2+ e a entrada externa de Ca2+ são avaliadas usando uma estação de trabalho de imagem disponível comercialmente em células carregadas com Fura-2 / AM expostas a ATP, cafeína ou tapsigargina (TG). Este método oferece uma técnica estável e eficiente para isolar, cultivar e identificar células-tronco CD34+ residentes na parede vascular, proporcionando uma oportunidade para estudos in vitro sobre os mecanismos regulatórios de VW-SCs e a triagem de medicamentos direcionados.
A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-11. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fat....
Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medi.......
Isolamento e purificação de CD34+ VW-SCs
A alta pureza dos VW-SCs CD34+ é obtida a partir da adventícia da artéria aórtica e mesentérica de camundongo por fixação tecidual e classificação de microesferas magnéticas. A porcentagem de células CD34+ na parede do vaso é geralmente de 10% a 30%. A citometria de fluxo confirma que a pureza das células CD34+ obtidas por classificação magnética de esferas é superior a 90% (Fig.......
Este estudo fornece um método rápido e conveniente para a obtenção de VW-SCs CD34+ funcionais da aorta e artérias mesentéricas de camundongos. Os VW-SCs CD34+ obtidos por este método têm atividade proliferativa e propriedades de diferenciação multidirecional. Os receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs), os receptores de rianodina (RyRs) e os canais de cálcio operados por armazenamento medeiam a liberação e entrada de Ca2+ em VW-SCs CD34+
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82070502, 31972909, 32171099), do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan da Província de Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Os autores gostariam de agradecer a Qingbo Xu, da Universidade de Zhejiang, pela ajuda com a cultura de células, e os autores reconhecem a assistência científica e técnica da plataforma de citometria de fluxo na Southwest Medical University.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2% gelatin solution | Sigma | G1393 | |
Anti-CD31 antibody | R&D | AF3628 | |
Anti-CD34 antibody | Abcam | ab81289 | |
Anti-c-kit antibody | CST | 77522 | |
Anti-FITC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-FITC MicroBeads MACS | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-Flk- 1 antibody | Abcam | ab24313 | |
Anti-Ki67 antibody | CST | 34330 | |
Anti-PDGFRα antibody | Abcam | ab131591 | |
Anti-Sca- 1 antibody | Invitrogen | 710952 | |
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC | eBioscience Invitrogen | 11-1401-82 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC | eBioscience Invitrogen | 17-0311-82 | |
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 | Miltenyi Biotec | 130-117-775 | |
cell culture hood | JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD | SW-CJ-2FD | |
Centrifuge | CENCE | L530 | |
CO2 incubators | Thermofisher Scientific | 4111 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | zeiss 980 | |
DMEM High Glucose Medium | ATCC | 30-2002 | |
EBM-2 culture medium | Lonza | CC-3162 | |
FACSMelody | BD Biosciences | ||
FACSMelody™ System | BD | ||
Fetal bovine serum | Millipore | ES-009-C | |
FM-2 culture medium | ScienCell | 2331 | |
Fura-2/AM | Invitrogen | M1292 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermofisher Scientific | A32731 | |
Leukemia inhibitory factor | Millipore | LIF2010 | |
Microscope | Olympus | IX71 | |
MiniMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-312 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Beyotime | C0224 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | |
TILLvisION 4.0 program | T.I.L.L.Photonics GmbH | polychrome V | |
VWF Monoclonal Antibody (F8/86) | Thermofisher Scientific | MA5-14029 | |
β-Mercaptoethanol | Thermofisher Scientific | 21985023 |
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