Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Abstract

As células-tronco e progenitoras residentes na parede vascular CD34+ residentes (VW-SCs) são cada vez mais reconhecidas por seu papel crucial na regulação da lesão e reparo vascular. Estabelecer um método estável e eficiente para cultivar VW-SCs CD34+ murinos funcionais é essencial para investigar ainda mais os mecanismos envolvidos na proliferação, migração e diferenciação dessas células sob várias condições fisiológicas e patológicas. O método descrito combina triagem de esferas magnéticas e citometria de fluxo para purificar VW-SCs CD34+ residentes em cultura primária. As células purificadas são então identificadas funcionalmente por meio de coloração por imunofluorescência e imagem de Ca2+ . Resumidamente, as células vasculares da adventícia da aorta murina e da artéria mesentérica são obtidas por meio da fixação de blocos teciduais, seguida de subcultura até atingir uma contagem de células de pelo menos 1 × 107. Posteriormente, os VW-SCs CD34+ são purificados usando classificação magnética de esferas e citometria de fluxo. A identificação de VW-SCs CD34+ envolve a coloração por imunofluorescência celular, enquanto a multipotência funcional é determinada pela exposição das células a um meio de cultura específico para diferenciação orientada. Além disso, a liberação funcional interna de Ca2+ e a entrada externa de Ca2+ são avaliadas usando uma estação de trabalho de imagem disponível comercialmente em células carregadas com Fura-2 / AM expostas a ATP, cafeína ou tapsigargina (TG). Este método oferece uma técnica estável e eficiente para isolar, cultivar e identificar células-tronco CD34+ residentes na parede vascular, proporcionando uma oportunidade para estudos in vitro sobre os mecanismos regulatórios de VW-SCs e a triagem de medicamentos direcionados.

Introduction

A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-11. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fat....

Protocol

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medi.......

Representative Results

Isolamento e purificação de CD34+ VW-SCs
A alta pureza dos VW-SCs CD34+ é obtida a partir da adventícia da artéria aórtica e mesentérica de camundongo por fixação tecidual e classificação de microesferas magnéticas. A porcentagem de células CD34+ na parede do vaso é geralmente de 10% a 30%. A citometria de fluxo confirma que a pureza das células CD34+ obtidas por classificação magnética de esferas é superior a 90% (Fig.......

Discussion

Este estudo fornece um método rápido e conveniente para a obtenção de VW-SCs CD34+ funcionais da aorta e artérias mesentéricas de camundongos. Os VW-SCs CD34+ obtidos por este método têm atividade proliferativa e propriedades de diferenciação multidirecional. Os receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs), os receptores de rianodina (RyRs) e os canais de cálcio operados por armazenamento medeiam a liberação e entrada de Ca2+ em VW-SCs CD34+

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82070502, 31972909, 32171099), do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan da Província de Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Os autores gostariam de agradecer a Qingbo Xu, da Universidade de Zhejiang, pela ajuda com a cultura de células, e os autores reconhecem a assistência científica e técnica da plataforma de citometria de fluxo na Southwest Medical University.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2% gelatin solutionSigmaG1393
Anti-CD31 antibodyR&DAF3628
Anti-CD34 antibodyAbcamab81289
Anti-c-kit antibodyCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 antibodyAbcamab24313
Anti-Ki67 antibodyCST34330
Anti-PDGFRα antibodyAbcamab131591
Anti-Sca- 1 antibodyInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITCeBioscience  Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
cell culture hoodJIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
Centrifuge  CENCE  L530
CO2 incubators            Thermofisher Scientific4111
Confocal laser scanning microscope Zeiss zeiss 980  
DMEM High Glucose MediumATCC30-2002
EBM-2 culture mediumLonzaCC-3162
FACSMelody  BD Biosciences
FACSMelody™ System BD
Fetal bovine serumMilliporeES-009-C
FM-2 culture mediumScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermofisher Scientific   A32731
Leukemia inhibitory factorMilliporeLIF2010
Microscope OlympusIX71
MiniMACS   Starting KitMiltenyi Biotec130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionBeyotimeC0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141
Stereo Microscope OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 program  T.I.L.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)Thermofisher Scientific MA5-14029
β-MercaptoethanolThermofisher Scientific21985023

References

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Palavras chave Isolamento Imunomagn ticoC lulas Tronco CD34 Residentes na Parede VascularPurifica oCitometria de FluxoIdentifica o FuncionalColora o por Imunofluoresc nciaImagem de Ca2Aorta Murina e Art ria Mesent ricaAdvent ciaCultura de C lulasMultipot nciaDiferencia oATPCafe naThapsigargin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved