Иммуномагнитная изоляция CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки от мышей

Summary

В этом исследовании был разработан стабильный и эффективный метод выделения, культивирования и функционального определения CD34⁺ стволовых клеток сосудистой стенки (CD34⁺ VW-SCs). Этот простой в использовании и эффективный по времени метод изоляции может быть использован другими исследователями для изучения потенциальных механизмов, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Abstract

Резидентные CD34⁺ резидентные стволовые и прогениторные клетки сосудистой стенки (VW-SCs) получают все большее признание за их решающую роль в регулировании повреждения и восстановления сосудов. Создание стабильного и эффективного метода культивирования функциональных мышиных CD34⁺ VW-SC имеет важное значение для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в пролиферации, миграции и дифференцировке этих клеток при различных физиологических и патологических условиях. Описанный метод сочетает в себе скрининг магнитных шариков и проточную цитометрию для очистки первичных культивируемых резидентных CD34⁺ VW-SC. Затем очищенные клетки функционально идентифицируются с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации Ca²⁺ . Вкратце, сосудистые клетки из адвентиции мышиной аорты и брыжеечной артерии получают путем прикрепления тканевых блоков с последующим субкультивированием до достижения количества клеток не менее 1 × 10⁷. Впоследствии CD34⁺ VW-SC очищают с помощью магнитной сортировки шариков и проточной цитометрии. Идентификация CD34⁺ VW-SC включает клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание, в то время как функциональная мультипотентность определяется путем воздействия на клетки специфической питательной среды для ориентированной дифференцировки. Кроме того, функциональный внутренний выброс Ca²⁺ и внешний вход Ca²⁺ оцениваются с помощью коммерчески доступной рабочей станции визуализации в нагруженных Fura-2/AM клетках, подвергшихся воздействию АТФ, кофеина или тапсигаргина (TG). Этот метод предлагает стабильную и эффективную технику выделения, культивирования и идентификации CD34⁺ стволовых клеток в сосудистой стенке, обеспечивая возможность проведения in vitro исследований регуляторных механизмов VW-SC и скрининга таргетных препаратов.

Introduction

Сосудистая стенка играет ключевую роль в развитии сосудов, гомеостатической регуляции и прогрессировании сосудистых заболеваний. В последние годы многочисленные исследования выявили наличие различных линий стволовых клеток в артериях. В 2004 году группа профессора Цинбо Сюя впервые сообщила о существовании сосудистых стволовых/прогениторных клеток на периферии сосудистой стенки взрослого человека, экспрессирующих CD34, Sca-1, c-kit и Flk-1¹. Эти сосудистые стволовые клетки демонстрируют разнонаправленный потенциал дифференцировки и пролиферации. В нормальных условиях они остаются относительно спокойными; Однако при активации определенными факто....

Protocol

Это исследование было одобрено, и с животными обращались в соответствии с Руководством по обращению с лабораторными животными и их использованию в Китае. Исследование строго соответствовало этическим требованиям экспериментов на животных, с одобрения Комитета по этике животных (номе.......

Discussion

Это исследование обеспечивает быстрый и удобный метод получения функциональных CD34⁺ VW-SC из аорты и брыжеечных артерий мышей. CD34⁺ VW-SC, полученные этим методом, обладают пролиферативной активностью и свойствами разнонаправленной дифференцировки. Трифосфатинозитол-1,4,5-трифосф.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023