T.C. נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, מענק הכשרה לביופיזיקה מולקולרית GM-08295 ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר DGE 2146752. ר.ג. וב.ה. נתמכו על ידי מענק R21-GM135666 של המכון הלאומי לבריאות שהוענק לר.ג. וב.ה. עבודה זו מומנה חלקית באמצעות מענק R35-GM127018 של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים שהוענק ל- E.N. E.N. הוא חוקר במכון הרפואי הווארד יוז.

ייצור רשתות זיקה סטרפטווידין למחקרים מבניים של Cryo-EM

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257 (2018).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM.">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li><li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide:+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples.">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li><li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy.">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li><li>Han, B. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules.">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li><li>Han, B. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals.">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li><li>Dom&#237;nguez-Mart&#237;n, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states.">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li><li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications.">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).</li><li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids.">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד ליצור רשתות זיקה סטרפטאווידין ולהשתמש בהן וכיצד לעבד את הנתונים המכילים את אות עקיפה סטרפטאווידין. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת.
ניתן לייחס אצוות רשת לא מוצלחות למספר שגיאות נפוצות. מקור השגיאה הנפוץ ביותר מגיע משימוש בריאגנטים מיושנים או באיכות ירודה. חשוב במיוחד להכין את תמיסת השומנים הביוטיניליים בדיוק כפי שמתואר בפרוטוקול. יתר על כן, כל זיהומים, כגון שאריות חומרי ניקוי על כלי המעבדה או שמנים נוכחים באופן טבעי על העור, יכול להשפיע על איכות גבישי סטרפטווידין, ומכאן, את איכות התמונות המתקבלות. לכן מומלץ לבצע שלושה מחזורי שטיפה לרשתות לפני אידוי הפחמן הראשון כדי להסיר זיהום פעילי שטח אפשרי מיצרן הרשת (שלב 2.1). בנוסף, זיהום או טומאה של שמן קיק נצפו כדי לעכב היווצרות גבישים על הרשת.
ביצוע ואיסוף monolayer שומנים היא משימה כי יש לתרגל כמה פעמים כדי לקבל תחושה של נפחי שומנים קטנים. אין זה יוצא דופן ששלב זה נכשל בפעמיים או שלוש הראשונות לפני שניתן לייצר שכבה אחידה מספקת של שומנים, כפי שמשתקף בסופו של דבר באיכות גבישי הסטרפטאבידין שנראים ברשתות מוכתמות באופן שלילי (איור 4C).
חשוב לעולם לא לתת לחלק האחורי (צד הזהב, צד השומנים) של הרשת להירטב במהלך תהליך ייצור הרשת (שלבים 3.12-3.20). במקרה שהישבן נרטב, מומלץ להשליך את הרשת. הדבר עלול לגרום להופעתן של בועיות שומנים גדולות המשבשות את איכות התמונה (איור 5D) (שורה 3, טבלה 1). שלפוחיות שומנים ניתן לראות גם עקב כביסה מספקת לאחר monolayer השומנים מוחל (שלב 3.13). שלוש שטיפות עוקבות באמצעות חיץ התגבשות מומלצות לאחר נגיעה בשכבה האחידה של השומנים לפני הוספת סטרפטווידין.
לאחר ששכבה דקה של פחמן התאדה על רשתות משובצות טרהלוז, החלק האחורי של הרשת יכול להיות רטוב מבלי לפגוע באיכות הסריג. לדוגמה, הרטבה של החלק האחורי נצפתה לעתים קרובות כאשר מאגר הדגימה מכיל אפילו כמויות מינימליות של חומר ניקוי. הרטבה של החלק האחורי על ידי הדגימה עלולה לגרום לקשירה לא ספציפית של דגימות לסרט הפחמן הדק בצד האחורי, מה שמקטין את היעילות של מניעת התפזרות חלקיקים לממשק אוויר-מים או שימוש בקשירת זיקה לאסטרטגיות טיהור ברשת. במידת האפשר, הוסף את הדגימה לרשת בהיעדר חומר ניקוי. לאחר מכן ניתן להוסיף חומרי ניקוי ותוספים אחרים במהלך שלבי שטיפת הרשת או להוסיף בשלב אחרון לפני ויטריפיקציה. זוהי מגבלה אחת לשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין; עם זאת, אם המטרה היא לשפר את האוריינטציה המועדפת, הכנת הדגימה עם חוצצים, כולל חומר ניקוי, בוצעה בהצלחה11.
מקור טעות נפוץ ניתן לייחס לגיל הרשתות ביחס לשני שלבי אידוי הפחמן (שלב 2.3 ושלב 3.21). בפרוטוקול זה, תקופת ההמתנה המומלצת היא 5-7 ימים לאחר אידוי הפחמן האחורי לפני השימוש ברשתות סטרפטווידין עבור cryo-EM. כאשר נעשה שימוש ברשתות זמן קצר מדי לאחר הייצור, הסריג וחד-שכבת השומנים נצפו מתגייסים החוצה מחורי הרשת. תצפית דומה יכולה להתבצע כאשר הרשתות ישנות מדי ומשתמשים בהן לאחר שישה חודשים (איור 5A) (שורה 1, טבלה 1). אנו משערים כי תצפית זו מוסברת על ידי שינויים בהידרופוביות של גב הפחמן המיושם לייצוב גבישי החד-שכבה והסטרפטאבידין. בנוסף, סריגי סטרפטאבידין עשויים להיראות פסיפס (איור 5B) (שורה 3, טבלה 1) ושבורים הן בכתם שלילי והן ב-cryo-EM אם החד-שכבה מיושמת על רשתות שבהן שכבת אידוי הפחמן הראשונה (שלב 2.3) לא התיישנה מספיק.
מקור נפוץ נוסף לטעות ניתן לייחס לשבריריות של החד-שכבה הגבישית סטרפטאבידין (חד-שכבה שומנית היא עצמה נוזלית ויכולה להתרחב או לדחוס באופן הפיך). אידוי הפחמן האחורי (שלב 3.21) מספק יציבות קריטית הן לסריג החד-שכבתי והן לסריג הסטרפטאבידין במהלך ספיחת הדגימה, השטיפה ותהליך הכתמת cryo-EM. בהיעדר אידוי פחמן מספק לחלק האחורי של הרשת, סריגי סטרפטווידין ייראו לעתים קרובות מקוטעים לאחר כתמים/הקפאה (איור 5C) (שורה 2, טבלה 1). בפרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש במקפיא צלילה אוטומטי חד צדדי לכתמים חד צדדיים. שיטה זו מניבה תנאי הכתמה הניתנים לשחזור גבוה המשמרים את סריג הסטרפטאבידין בתהליך ההקפאה ומאפשרים אופטימיזציה יעילה של יישום הדגימה ופרמטרי ההקפאה. לחלופין, נעשה שימוש במכשירים אוטומטיים אחרים להקפאת צלילה בשילוב עם הקפאה ידנית. לשם כך, פונקציית הניקוי בפועל מושבתת בהגדרות המכשיר, והרשת נמחקת במקום זאת על ידי הגעה עם זוג פינצטה המחזיקה נייר ניקוי דרך הכניסה הצדדית. שיטה זו יכולה להשיג תוצאות באיכות גבוהה עבור מעבדות ללא מכשיר הקפאה חד צדדי והקפאה; עם זאת, יכולת השחזור מרשת לרשת מאתגרת.
בעוד שלשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין יש יתרונות רבים, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות של שיטה זו. בשל אופי ההליך, בדרך כלל לא ניתן להעריך את איכות סריג הסטרפטאווידין עד להשלמת התהליך כולו. מומלץ לסנן במהירות את האיכות של כל אצווה על ידי כתם שלילי לפני הקפאת דגימות. בשל האות שנתרם על ידי סריג סטרפטווידין לתמונות הגולמיות, זה יכול להיות מאתגר במקרים מסוימים להעריך, מתוך התמונות בלבד, אם יש מספר מספיק של חלקיקים שלמים ומפוזרים. מאותה סיבה, עיבוד מהיר של נתוני cryo-EM במהלך רכישת נתונים אינו אפשרי אלא אם הליך חיסור אות סטרפטאווידין נכלל בצינור טרום עיבוד הנתונים. מכיוון שאות הסטרפטאווידין מופחת בדרך כלל מהתמונות המתוקנות בתנועה ולא מהמסגרות עצמן, ליטוש בייסיאני, כפי שמיושם בחבילות תוכנה פופולריות, עלול להיכשל בעת שימוש בפרוצדורות החיסור כמתואר. לכן מומלץ לבצע תיקון תנועה במספר טלאים כדי למזער את תנועת החלקיקים מתחילת עיבוד הנתונים16.
למרות מגבלות אלה, רשתות זיקה סטרפטווידין מציעות יתרונות רבים. שני יתרונות עיקריים שרשתות זיקה סטרפטאווידין מספקות על פני רשתות קריו-EM סטנדרטיות עם חורים פתוחים הם אמצעי להגן על דגימות מממשק אוויר-מים ולרכז דגימות בשפע נמוך (10-100 ננומטר) ברשת. שכבות תמיכה אחרות, כגון פחמן ותחמוצת גרפן, יכולות לשמש גם כאסטרטגיות להתגבר על צווארי בקבוק אלה בהכנת הדגימות. בדוגמה אחת, רשתות זיקה סטרפטווידין היו הפתרון היחיד להשגת שחזור שלם של אינטראקציה חלבונית-חומצת גרעין שלא התאימה לגישות הצלבה. 12
יתרון משמעותי נוסף שמספקות רשתות זיקה סטרפטאבידין הוא פתרון לדגימות הנספחות לשכבות תמיכה אחרות, כגון פחמן או תחמוצת גרפן, עם כיוונים מועדפים המעכבים את היכולת לקבל שחזור תלת ממדי של הדגימה המעניינת. ביוטינילציה אקראית של דגימות באמצעות ערכות זמינות מסחריות מאפשרת חיבור אקראי של הדגימה המעניינת לשכבה החד-שכבתית של סטרפטאבידין כדי להשיג תצוגות פוטנציאליות נוספות כדי להתגבר על אתגר זה.
בנוסף, רשתות זיקה סטרפטווידין מציעות יתרונות ייחודיים לרשתות מבוססות זיקה. הזיקה הגבוהה והספציפיות של אינטראקציית סטרפטווידין-ביוטין מאפשרות צימוד של רשתות זיקה סטרפטווידין עם זרימות עבודה אחרות המערבות ביוטין כדי לטהר קומפלקסים של עניין. באחת הדוגמאות שפורסמו, המחברים שיתקו קומפלקס על רשתות זיקה סטרפטאווידין ודגרו על שותף מחייב של סטויכיומטריה לא ידועה בעודף גדול. לאחר שטיפת כל חלבון לא קשור, סופר מורכב כראוי התקבל וניתן לנתח מיד עם cryo-EM11. יישום עתידי אפשרי אחד עשוי להיות שילוב תגי חלבון קושרי סטרפטווידין, מערכת Avi-tag, או גישות תיוג קרבה עם רשתות זיקה סטרפטווידין כדי לחלץ חלבונים בודדים ו / או קומפלקסים חלבוניים ישירות ממקורות רקומביננטיים או אנדוגניים ללא תוכניות טיהור משוכללות סטנדרטיות.
על ידי מתן פרוטוקול זה, מעבדות אמורות להיות מסוגלות לשחזר בקלות את הייצור של רשתות זיקה סטרפטאווידין ולבסס אותן ככלי נפוץ יותר לניתוח מבני של קומפלקסים חלבוניים על ידי cryo-EM.

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-מיקרוסקופית (cryo-EM) חוללה מהפכה בתחום הביולוגיה המבנית בכך שאפשרה קביעת מבנה מקרומולקולרי של דגימות גדולות, גמישות והטרוגניות שבעבר לא היו נגישות באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או תהודה מגנטית גרעינית1. שיטה זו פועלת על ידי מקרומולקולות הקפאת הבזק בתמיסה ליצירת שכבה דקה של קרח זגוגי שניתן לאחר מכן לצלם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. בשנים האחרונות, התקדמות משמעותית הן בחומרת המיקרוסקופ והן בתוכנת עיבוד התמונה הרחיבו עוד יותר את סוגי הדגימות המתאימות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM.
עם זאת, הכנת דגימות דקות ומזוגגות נותרה אחד השלבים הקריטיים ביותר בקביעת מבנה מקרומולקולרי על ידי cryo-EM. דגימות ביולוגיות הן לעתים קרובות דינמיות, שבירות, נוטות לדנטורציה, ולפעמים זמינות רק בכמויות קטנות למחקרי cryo-EM. במהלך תהליך הניקוי, חלקיקים אלה מתקשרים עם ממשק אוויר-מים הידרופובי, מה שיכול לגרום לאוריינטציות מועדפות על חלקיקים, פירוק קומפלקסים שבירים, דנטורציה חלקית או מלאה של הדגימה, וצבירה 2,3,4. השימוש בדטרגנטים או חומרים פעילי שטח אחרים, הצלבה כימית וספיחת דגימות לתמיכה בשכבות הן אסטרטגיות נפוצות לשימור דגימות ביולוגיות בתהליך ההקפאה. שכבות תמיכה כגון תחמוצת גרפן 5,6,7 או פחמן אמורפי8 פועלות גם לריכוז חלקיקים ברשת על ידי ספיחה כאשר הדגימה זמינה בכמויות מוגבלות. עם זאת, שיטות אלה אינן כלליות או אמינות, ואופטימיזציה של הכנת הרשת יכולה לגזול זמן רב או להיכשל לחלוטין.
רשתות זיקה סטרפטווידין 9,10 פותחו כדי להתגבר על חסרונות אלה ולספק שיטה מתונה וישימה בדרך כלל לתפוס את מכלול האינטרסים ולהגן עליו מפני ממשק אוויר-מים. רשתות אלה משתמשות בסריג גבישי סטרפטאווידין דו-ממדי (דו-ממדי) הגדל על שכבה אחת של שומנים ביוטיניליים על הרשת. לאחר שהדגימות עצמן עוברות ביוטינילציה (לעתים קרובות בדלילות ובאקראי, כלומר ביוטין אחד בממוצע לכל קומפלקס), ניתן ליישם אותן על הרשת המצופה סטרפטווידין. מכיוון שספיחה של דגימות מסתמכת על זיקה גבוהה מאוד בין סטרפטאווידין לביוטין, ניתן להשתמש בריכוזי דגימה נמוכים של עד 10 ננומטר עם רשתות אלה. ערכות ביוטינילציה זמינות מסחרית עבור חלבונים ופריימרים ביוטיניל עבור קומפלקסים המכילים DNA מקלים יחסית על הצמדת הביוטין הדרוש לרוב הדגימות המעניינות. בנוסף לריכוז הדגימה והרחקתה מהממשק האוויר-מים המזיק במהלך ההכתמה, הביוטינילציה האקראית של שאריות ליזין אחת או רק כמה יכולה לשפר באופן משמעותי את טווח הכיוונים של המולקולה המעניינת ברשת cryo-EM, כפי שהודגם במספר מחקרים11. בעוד שהאות מגביש הסטרפטאווידין הבסיסי קיים בתמונות הגולמיות, ניתן להסיר בקלות סכמות עיבוד נתונים הכוללות סינון פורייה של השתקפויות בראג חדות מהגביש במהלך עיבוד נתונים מוקדם, ובסופו של דבר לאפשר שחזורים ברזולוציה גבוהה של המדגם המעניין 11,12,13 . כאן, פרוטוקול אופטימלי, שלב אחר שלב מסופק לייצור חזק של רשתות זיקה סטרפטאבידין ושימוש לאחר מכן בניסויי cryo-EM. הפרוטוקול שסופק צפוי להסתיים על פני תקופה של שבועיים (איור 1A). החלקים הראשונים של הפרוטוקול מתארים את הכנת הריאגנטים, הטיפול המוקדם ברשתות ואת שלבי אידוי הפחמן הראשונים. לאחר מכן, מתוארות הוראות להכנת מונושכבה שומנים וצמיחה של גבישי סטרפטאבידין על רשתות EM. בנוסף, ניתנות הוראות לשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין בניסויי EM כתמים שליליים ו- cryo-EM. לבסוף, נהלים ניתנים להסרת אות סטרפטווידין ממיקרוגרפים לאחר רכישת נתוני cryo-EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

רשתות זיקה סטרפטאווידין מספקות אסטרטגיות להתגבר על אתגרי הכנת דגימות קריו-אלקטרונים נפוצים רבים (cryo-EM), כולל דנטורציה של דגימות וכיוונים מועדפים שיכולים להתרחש עקב ממשק אוויר-מים. רשתות זיקה Streptavidin, לעומת זאת, משמשות כיום על ידי מעבדות cryo-EM מעטות מכיוון שהן אינן זמינות מסחרית ודורשות תהליך ייצור זהיר. גבישי סטרפטאבידין דו-ממדיים גדלים על שכבה חד-שכבתית ליפידית ביוטינילית המיושמת ישירות על רשתות קריו-EM סטנדרטיות של פחמן חורי. האינטראקציה בעלת הזיקה הגבוהה בין סטרפטאווידין לביוטין מאפשרת קשירה עוקבת של דגימות ביוטינילציה המוגנות מממשק אוויר-מים במהלך הכנת דגימות קריו-EM. בנוסף, רשתות אלה מספקות אסטרטגיה לריכוז דגימות זמינות בכמויות מוגבלות וטיהור קומפלקסים חלבוניים בעלי עניין ישירות על הרשתות. כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לייצור חזק של רשתות זיקה סטרפטאווידין לשימוש בניסויי cryo-EM וכתמים שליליים. בנוסף, מדריך לפתרון בעיות כלול עבור אתגרים נפוצים כדי להפוך את השימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין לנגיש יותר לקהילת cryo-EM הגדולה יותר.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

מחבר זרקור: שיפור הכנת דגימת Cryo-EM עם גישת סטרפטווידין-ביוטין

ייצור רשת Streptavidin-Affinity להכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron

There have been many recent technological advances in cryo-EM, including advancements in the microscope hardware itself that improve the overall quality of the images, and also developments in software that are used to process the cryo-EM images that can start to deal with the large amounts of heterogeneity present in many of the samples. The sample preparation remains one of the largest bottlenecks in cryo-EM. The sample quantity may be limiting and proteins tend to absorb to the hydrophobic air-water interface during vitrification.This can lead to sample denaturation, the breaking apart of larger protein complexes and preferred particle orientations that are present in the cryo-EM images. These grids take advantage of the high-affinity interaction between streptavidin and biotin to tether biotinylated samples and protect them from the hydrophobic air-water interface. We can work with very low sample amounts, and random biotin elation of samples offers a strategy to overcome preferential orientation issues that may be observed when using other support layers.

לאחר אידוי הפחמן בשלב 3.21 (בדרך כלל לאחר שבוע), ניתן להשתמש ברשתות זיקה סטרפטווידין להכנת דגימת cryo-EM או כתם שלילי בהתאם להליכים המתוארים בשלבים 4 ו -5. מיקרוגרף מייצג שצולם באמצעות גלאי K3 על טיטאן קריוס בהגדלה של 81,000X עם גודל פיקסל של 1.05 Å של דגימה ביוטינילית שהוקפאה עם רשתות זיקה סטרפטאווידין מוצג באיור 4A. היווצרות סריג מוצלחת נצפית על-ידי תבנית הרשת הרציפה המופיעה ברקע התמונה. ניתן לראות זאת בקלות רבה יותר על-ידי תבנית העקיפה שמופיעה בהתמרת פורייה המהירה (FFT) המוצגת באיור 4A (מימין). לאחר איסוף הנתונים, בהתאם להליך המתואר בשלב 6 של פרוטוקול זה, ניתן להסוות באופן חישובי את האות שנתרם לתמונה על-ידי סריג הסטרפטאווידין כדי לייצר מיקרוגרף מופחת (איור 4B) שניתן להשתמש בו לשלבי עיבוד הנתונים הבאים. FFT באיור 4B (מימין) מראה שתבנית העקיפה שנצפתה באיור 4A (מימין) הוסרה בהצלחה מהתמונה המקורית.
איור 4C מראה מיקרוגרף לדוגמה שצולם במיקרוסקופ Tecnai 12 בהגדלה של 49,000x עם גודל פיקסלים של 1.6 Å של דגימה ביוטינילית הקשורה לרשתות זיקה של סטרפטאווידין ומוכתמת באופן שלילי באמצעות פורמט אורניל. רשתות הוכנו בהתאם להליך המתואר בשלב 4 של פרוטוקול זה, והותירו סרט עבה יותר של כתמים.
ישנן מספר תצפיות נפוצות כאשר הליך ייצור רשת סטרפטאווידין אינו מוצלח המתוארות בהמשך פרק הדיון ובטבלה 1. תרשים 5 מציג מספר דוגמאות לתצפיות אלה. איור 5A מראה מיקרוגרף של רשת זיקה לסטרפטאווידין מוכתמת באופן שלילי ששימשה מאצווה בת יותר משישה חודשים. החד-שכבה התגייסה מהחורים ברדיד הפחמן של רשתות הקוואנטיפויל ונצפתה בממדים דומים לחורים ברשת. איור 5B מראה דוגמה של גבישי סטרפטווידין בעלי פסיפסיות גבוהה שהופכים מופרעים בקלות במהלך הליכי הכנת הדגימה. איור 5C מראה מיקרוגרף מייצג מרשת זיקה סטרפטאווידין שבה אידוי הפחמן בשלב 3.21 דק מדי או מושמט. סריג הסטרפטאבידין הפך מקוטע במהלך תהליך הכנת דגימת cryo-EM. איור 5D מראה רשת זיקה סטרפטאבידין מוכתמת שלילית, שיש לה זיהום משלפוחיות שומנים, ככל הנראה בגלל שטיפות לא מספיקות במהלך שלב 3.13 או שצד הזהב של הרשת נרטב במהלך שלבים 3.13-3.20. עיין בסעיף הדיון ובטבלה 1 לקבלת אסטרטגיות להתגברות על בעיות נפוצות אלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של הליך ייצור רשת זיקה סטרפטאווידין. (A) ציר זמן סקירה כללית של הליך ייצור רשת זיקה סטרפטווידין. ניתן להשלים את ההליך כולו במשך שבועיים הדורשים שני שלבי אידוי פחמן ושבוע לאחר כל אחד מהם כדי לאפשר לפחמן להזדקן מספיק. (B) זום לאור ריבוע רשת של רשת זיקה סטרפטאווידין המציג את השכבות המרכיבות את הרשת לאחר השלמת תהליך הייצור, כולל רשת cryo-EM סטנדרטית עם מטילי זהב וסרט פחמן חורי, שכבת הפחמן המתאדה הראשונה, חד-שכבה ליפידית, גביש סטרפטווידין דו-ממדי ושכבת תמיכת הפחמן המתאדה בישבן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> איור 2: התגבשות חד-שכבתית ליפידית וסטרפטאווידין (A) תמונות המדגימות כיצד ליצור בהצלחה את חד-שכבת השומנים בתוך צלחת הפטרי הקטנה תוך שימוש באבקת טלק ליצירת גבול לשמן הקיקיון שיוצר לחץ קבוע על פני השטח תוך יצירת חד-שכבה ליפידית. (B) תמונות המדגימות כיצד לגדל גבישי סטרפטאבידין על רשתות cryo-EM. ראשית, צד הפחמן של הרשתות נוגע בחד-שכבה השומנית ולאחר מכן שלוש שטיפות רצופות במאגר ההתגבשות. Streptavidin מתווסף, רשתות מודגרים בתא לחות במשך 2 שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> איור 3: פרמטרים לדוגמה עבור קובץ process_subtraction.cfg לביצוע חיסור סריג סטרפטאווידין ממיקרוגרפים (שלב 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות של ייצור מוצלח של רשת זיקה סטרפטאווידין. (A) מיקרוגרף Cryo-EM של קומפלקסים חלבוניים/נוקלאוזומים ביוטינילטים שהוכנו עם רשתות זיקה סטריפטאווידין ביתיות. ה- FFT מוצג מימין ומראה את דפוס עקיפה של גבישי סטרפטאבידין. (B) אותו מיקרוגרף כמו בלוח A מוצג לאחר הליך חיסור הסריג כדי להסיר את האות מגביש הסטרפטאווידין הדו-ממדי מהתמונה המקורית. (C) דוגמה למיקרוגרף המתקבל מצביעה שלילית של דגימה ביוטינילית הקשורה לרשתות זיקה סטרפטווידין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> איור 5: תוצאות מייצגות של ייצור רשת זיקה סטרפטאווידין לא מוצלח . (A) מיקרוגרף המראה את הניוד של חד-שכבת הסטרפטאווידין מחורי הרשת כאשר הרשתות בנות יותר משישה חודשים. (B) מיקרוגרף המראה סריגי סטרפטאבידין עם פסיפס גבוה שניזוקו בקלות במהלך הליכי הכנת דגימות cryo-EM וכתמים שליליים. (C) מיקרוגרף המראה פיצול של סריג הסטרפטאווידין במהלך הכנת דגימת cryo-EM כאשר שכבת אידוי הפחמן בשלב 3.21 דקה מדי או מושמטת. (D) מיקרוגרף מייצג המזוהם בשלפוחיות שומנים ככל הנראה עקב כביסה לא מספקת במהלך שלב 3.13 או שצד הזהב של הרשת נרטב במהלך שלבים 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מדריך לפתרון בעיות כדי להתגבר על אתגרים נפוצים שבהם נתקלים במהלך ייצור לא מוצלח של רשת זיקה סטרפטאווידין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ קידוד משלים 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 4: bg_drill_hole.מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 5: bg_FastSubtract_standard.מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 7: bg_push_by_rot.מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation at JoVE.com

פרוטוקול שלב אחר שלב לייצור רשתות זיקה סטרפטאווידין מסופק לשימוש במחקרים מבניים של דגימות מקרומולקולריות מאתגרות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

לאחרונה חלו התפתחויות טכנולוגיות רבות ב- cryo-EM, כולל התקדמות בחומרת המיקרוסקופ עצמו המשפרת את האיכות הכוללת של התמונות, וגם התפתחויות בתוכנה המשמשת לעיבוד תמונות cryo-EM שיכולות להתחיל להתמודד עם כמויות גדולות של הטרוגניות הקיימות ברבות מהדגימות. הכנת הדגימה נותרה אחד מצווארי הבקבוק הגדולים ביותר ב- cryo-EM. כמות הדגימה עשויה להיות מגבילה וחלבונים נוטים להיספג לממשק אוויר-מים הידרופובי במהלך ויטריפיקציה.זה יכול להוביל לדנטורציה של דגימה, פירוק של קומפלקסים חלבוניים גדולים יותר וכיווני חלקיקים מועדפים שנמצאים בתמונות cryo-EM. רשתות אלה מנצלות את האינטראקציה בעלת הזיקה הגבוהה בין סטרפטאווידין וביוטין כדי לקשור דגימות ביוטיניליות ולהגן עליהן מפני ממשק אוויר-מים הידרופובי. אנו יכולים לעבוד עם כמויות דגימה נמוכות מאוד, והתרוממות ביוטין אקראית של דגימות מציעה אסטרטגיה להתגבר על בעיות אוריינטציה מועדפות שניתן להבחין בהן בעת שימוש בשכבות תמיכה אחרות.

ייצור רשת Streptavidin-Affinity להכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron

Abstract