Fabricação de grade de afinidade por estreptavidina para preparação de amostras de microscopia crio-eletrônica

Summary

Um protocolo passo-a-passo para a fabricação de grades de afinidade à estreptavidina é fornecido para uso em estudos estruturais de amostras macromoleculares desafiadoras por microscopia crio-eletrônica.

Abstract

As grades de afinidade por estreptavidina fornecem estratégias para superar muitos desafios comumente encontrados de preparação de amostras por crio-microscopia eletrônica (crio-EM), incluindo desnaturação da amostra e orientações preferenciais que podem ocorrer devido à interface ar-água. Grades de afinidade com estreptavidina, no entanto, são atualmente utilizadas por poucos laboratórios de crio-EM porque não estão disponíveis comercialmente e requerem um processo de fabricação cuidadoso. Cristais bidimensionais de estreptavidina são cultivados em uma monocamada lipídica biotinilada que é aplicada diretamente às grades padrão de crio-EM holey-carbono. A interação de alta afinidade entre estreptavidina e biotina permite a ligação subsequente de amostras biotiniladas que são protegidas da interface ar-água durante a preparação de amostras crio-EM. Além disso, essas grades fornecem uma estratégia para concentrar amostras disponíveis em quantidades limitadas e purificar complexos proteicos de interesse diretamente nas grades. Aqui, um protocolo passo a passo otimizado é fornecido para a fabricação robusta de grades de afinidade de estreptavidina para uso em experimentos de crio-EM e coloração negativa. Além disso, um guia de solução de problemas está incluído para desafios comumente experimentados para tornar o uso de grades de afinidade de estreptavidina mais acessível para a comunidade crio-EM maior.

Introduction

A criomicroscopia eletrônica (crio-EM) revolucionou o campo da biologia estrutural ao permitir a determinação da estrutura macromolecular de amostras grandes, flexíveis e heterogêneas que antes eram inacessíveis por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear¹. Este método funciona congelando macromoléculas em solução para criar uma fina camada de gelo vítreo que pode ser posteriormente fotografada usando um microscópio eletrônico. Nos últimos anos, avanços significativos tanto no hardware do microscópio quanto no software de processamento de imagens expandiram ainda mais os tipos de amostras adequadas para a determinação de estruturas de alta resolução por crio-EM.

No entanto, a preparação de amostras finas e vitrificadas continua sendo uma das etapas mais críticas na determinação da estrutura macromolecular por crio-EM. As amostras biológicas são frequentemente dinâmicas, frágeis, propensas à desnaturação e, às vezes, só estão disponíveis em pequenas quantidades para estudos de crio-EM. Durante o processo de blotting, essas partículas interagem com a interface hidrofóbica ar-água, o que pode resultar em orientações preferenciais de partículas, desmontagem de complexos frágeis, desnaturação parcial ou completa da amostra e agregação ^2,3,4. O uso de detergentes ou outros surfactantes, a reticulação química e a adsorção de amostras para camadas de suporte são estratégias comuns para preservar amostras biológicas durante o processo de congelamento. Camadas de suporte como óxido de grafeno ^5,6,7 ou carbono^{amorfo 8} também funcionam para concentrar partículas na grade por adsorção quando a amostra está disponível em quantidades limitadas. No entanto, esses métodos não são gerais ou confiáveis, e a otimização da preparação da grade pode ser extremamente demorada ou falhar completamente.

Grades^de afinidade com estreptavidina9,10 foram desenvolvidas para superar essas deficiências e fornecer um método suave e geralmente aplicável para sequestrar o complexo de interesse e protegê-lo da interface ar-água. Essas grades utilizam uma rede cristalina de estreptavidina bidimensional (2D) cultivada sobre uma monocamada de lipídios biotinilados na grade. Depois que as amostras são biotiniladas (muitas vezes de forma esparsa e aleatória, o que significa uma biotina por complexo em média), elas podem ser aplicadas à grade revestida com estreptavidina. Como a adsorção da amostra depende da afinidade extremamente alta entre estreptavidina e biotina, concentrações de amostra tão baixas quanto 10 nM podem ser usadas com essas grades. Kits de biotinilação comercialmente disponíveis para proteínas e primers biotinilados para complexos contendo DNA tornam relativamente fácil anexar as metades de biotina necessárias à maioria das amostras de interesse. Além de concentrar a amostra e mantê-la longe da interface ar-água prejudicial durante o blotting, a biotinilação aleatória de um ou apenas alguns resíduos de lisina pode melhorar significativamente a gama de orientações da molécula de interesse na grade crio-EM, como demonstrado em vários estudos¹¹. Enquanto o sinal do cristal de estreptavidina subjacente está presente nas imagens brutas, esquemas de processamento de dados envolvendo a filtração de Fourier das reflexões nítidas de Bragg do cristal podem ser facilmente removidos durante o processamento inicial dos dados, permitindo, em última análise, reconstruções de alta resolução da amostra de interesse 11,12,13. Aqui, um protocolo passo a passo otimizado é fornecido para a produção robusta de grades de afinidade de estreptavidina e uso subsequente em experimentos de crio-EM. Espera-se que o protocolo fornecido seja concluído em um período de 2 semanas (Figura 1A). As primeiras partes do protocolo descrevem a preparação de reagentes, o pré-tratamento de grades e as primeiras etapas de evaporação de carbono. A seguir, são descritas instruções para a preparação da monocamada lipídica e o crescimento de cristais de estreptavidina em grades de EM. Além disso, são fornecidas instruções para o uso de grades de afinidade com estreptavidina em experimentos de coloração negativa EM e crio-EM. Finalmente, são fornecidos procedimentos para remover o sinal de estreptavidina das micrografias uma vez que os dados de crio-EM tenham sido adquiridos.

Protocol

1. Preparação dos reagentes

1. Diluir a estreptavidina comprada comercialmente até uma concentração final de 0,5 mg/mL em tampão de cristalização (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealose). Certifique-se de que a concentração final de trealose é de 10%. Alíquotas de congelamento instantâneo de 25-50 μL em azoto líquido e armazenar a -80 °C.
2. Dissolver o sal de sódio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) em 65:35:8 v/v/v clorofórmio/metanol/solvente de água para uma concentração lipídica final de 1 mg/mL. Conservar alíquotas de utilização única de 20-30 μL a -80 °C em frascos para injetáveis de vidro.
   NOTA: A preparação do solvente é mais precisa se feita por peso. Primeiro, combine 1,85 g de água ultrapura com 6,41 g de metanol de alta eficiência grau cromatografia líquida (HPLC) e adicione isso a 22,42 g de clorofórmio para preparar o solvente.
   CUIDADO: Leia e compreenda as fichas de dados de segurança dos fabricantes e as instruções recomendadas para o manuseio e descarte de solventes orgânicos de clorofórmio e metanol antes de iniciar este protocolo. Evitar o contato direto do metanol com a pele.

2. Pré-tratamento de grades

1. Lave a folha de carbono em grades de malha de ouro mergulhando duas vezes em 100% de clorofórmio e uma vez em 100% de etanol. Coloque grades em papel filtro limpo para secar. Repita o processo de lavagem por um total de três ciclos.
   NOTA: O sucesso reprodutível foi alcançado com grades de folha de carbono comercialmente disponíveis que têm um filme de carbono de 10-12 nm de espessura de carbono (ver lista de materiais) com tamanhos de furos que variam de 0,6-2 μm. Grades de folha de ouro comercialmente disponíveis e grades caseiras de carbono-holey, preparadas seguindo o protocolo de nanofabricação¹⁴ do Laboratório Rubinstein, também foram usadas com sucesso. Resultados menos reprodutíveis têm sido obtidos com grades comercialmente disponíveis que possuem filmes de carbono mais finos. Não use grades de cobre, pois o cobre reage com quaisquer aminas orgânicas que possam estar na amostra.
2. Depois que as grades secarem, evaporar uma camada espessa de carbono de 2,5-5 nm no lado carbono das grades de carbono. A espessura do carbono é controlada com a medição da espessura do filme de cristal de quartzo que é incorporada no evaporador de carbono fornecido no arquivo Tabela de Materiais .
3. Deixe o carbono recém-evaporado envelhecer (ou seja, tornar-se mais hidrofóbico) por 1 semana.

3. Preparação da rede de estreptavidina

NOTA: Para cultivar cristais de estreptavidina 2D nas grades EM holey-carbono, primeiro, uma monocamada lipídica biotinilada é aplicada aos orifícios do filme de carbono (Figura 1B) por transferência de Langmuir-Schaefer. A monocamada lipídica é formada seguindo as etapas subsequentes (Figura 2). O pó de talco cria um limite entre o óleo de mamona e a placa de Petri, e uma fina camada de óleo de mamona ajuda a manter a pressão de superfície constante quando a monocamada lipídica é formada. O lado que contém o carbono evaporado da etapa 2.2 é usado para pegar a monocamada, o excesso de lipídios é lavado com tampão de cristalização e a solução de estreptavidina é incubada na grade para cristalização.

1. Limpe a área da bancada com etanol 70%.
2. Enxaguar uma seringa de vidro de 5 μL várias vezes com clorofórmio para limpar. Deixe a seringa secar completamente antes de usar.
3. Lave as grades evaporadas de carbono novamente, ou seja, pouco antes do uso, mergulhando-as em etanol 100%. Deixe as grades secarem em papel filtro limpo.
4. Enquanto as grades estiverem secando, lave cada pinça anticapilar com 100% de clorofórmio e 100% de etanol. Deixe a pinça secar completamente.
5. No lado limpo do parafilme, prepare três gotas de 50 μL de tampão de cristalização (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealose) para cada grade que será feita.
6. Encher a tampa de uma placa de Petri não revestida de 35 mm com tampão de cristalização (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealose). Limpe a superfície com papel de lente.
7. Polvilhe talco de grau científico ao redor do perímetro da placa de Petri. Isso serve posteriormente como um indicador, na próxima etapa, de até onde o óleo de mamona se espalhou. Adicione talco suficiente para criar uma barreira que proteja o óleo de rícino de tocar a borda da placa de Petri. Adicionar muito pó de talco limita o espaço disponível para fazer a monocamada lipídica.
8. Mergulhe uma ponta de pipeta de 200 μL no óleo de rícino para obter uma gota de tamanho médio (aproximadamente 20 μL) que pende da ponta da pipeta. Toque esta gota na superfície do tampão na placa de Petri, onde ela se espalhará para formar uma película uniforme. A fina película de óleo resultante serve como um pistão¹⁵, que mantém uma pressão superficial constante quando uma monocamada lipídica é formada (passo 3.10).
   NOTA: É importante adicionar bastante óleo de rícino em vez de muito pouco, e é melhor adicionar como uma única gota. Deixe o óleo de mamona espalhar totalmente antes de fazer a monocamada lipídica.
9. Enxaguar a seringa de vidro de 5 μL uma ou duas vezes com o lipídio dissolvido antes de tomar uma alíquota para uso. Evite criar bolhas de ar no lipídio que preenche a seringa.
   NOTA: A seringa de vidro é lavada com lípido dissolvido no caso de qualquer clorofórmio residual remanescente do passo 3.2. O clorofórmio residual pode afetar a qualidade da monocamada resultante.
10. Dispense o menor volume possível (~0,5 μL) de lipídio da seringa e toque suavemente a gota pendente na superfície do filme de óleo de rícino. Observe que a solução lipídica rompe o filme de óleo de mamona no ponto de contato e que a monocamada lipídica resultante forma um círculo no centro do filme fino de óleo de mamona.
    1. Adicione várias gotas de lipídio sequencialmente ou adicione mais lipídio depois de fazer algumas grades, mas se muito for adicionado, o lipídio se espalhará além do limite do óleo de mamona e para o perímetro onde o pó de talco e qualquer surfactante contaminante foram sequestrados. Se isso ocorrer, o processo precisará ser reiniciado.
11. Pegue uma grade com uma pinça anticapilar para que o braço reto da pinça e o lado evaporado de carbono da grade fiquem voltados para a monocamada.
12. Transfira parte da monocamada para o carbono holey tocando o lado evaporado do carbono da grade para a monocamada por 1-2 s.
    NOTA: A transferência bem-sucedida é indicada pela superfície da grade tornando-se hidrofílica, fazendo com que uma tampa fina e esférica de tampão cubra toda a grade depois de ter sido levantada para longe da placa de Petri.
13. Tocar na tampa esférica do tampão que agora adere à grade, sequencialmente por 1 s cada, nas três gotas de 50 μL do tampão de cristalização que foram preparadas no parafilme na etapa 3.5.
    NOTA: Esta etapa tenta remover o máximo possível do excesso de lipídio, que cobre a superfície da capa esférica (em vez do filme de carbono anteriormente hidrofóbico), a fim de evitar a formação de vesículas lipídicas quando as amostras são vistas no microscópio eletrônico.
14. Adicionar cuidadosamente 4 μL de estreptavidina 0,5 mg/mL na tampa esférica restante do tampão de cristalização na grade.
15. Coloque a grade em uma câmara de umidade. Repita as etapas 3.11-3.14 para todo o lote de grades.
16. Incubar as grades à temperatura ambiente (TR) por 2 h dentro de uma câmara de umidade para evitar evaporação.
    NOTA: É importante que o lado dourado da grade não fique molhado em nenhum ponto após a aplicação da monocamada.
17. Após a incubação de 2 h, preparar uma gota de 300 μL de tampão de enxágue (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealose) para cada grade no lado limpo do parafilme.
    NOTA: O tampão de enxágue contém 50 mM KCl em vez de 150 mM KCl, que está no tampão de cristalização usado para as etapas 3.5-3.6.
18. Lave o excesso (não ligado) de estreptavidina, colocando a grelha sobre a gota de 300 μL de tampão de enxágue. Execute as etapas 3.18-3.20 para uma grade de cada vez. Evite deixar as grades na gota tampão de enxágue de 300 μL por longos períodos de tempo.
    NOTA: Apenas uma lavagem é realizada porque o cristal/monocamada de estreptavidina é frágil neste ponto. Cada vez que uma grade é levantada da superfície de uma gota de tampão de lavagem, a ponte líquida entre a grade e a gota de lavagem é rompida. No momento da ruptura, um gradiente de pressão transitório (pressão de sucção) é aplicado aos cristais monocamadas auto-suportados que abrangem os orifícios abertos do filme de carbono. Espera-se que essa pressão de sucção cause doming transitório do cristal monocamada, acompanhado pela expansão da área coberta pelos cristais. Se o aumento da área exceder o limite elástico do cristal, o cristal pode fraturar ou tornar-se desordenado.
19. Seque imediatamente a pinça anticapilar com um lenço sem fiapos para facilitar a liberação da grade em papel filtro na etapa seguinte. Pegue a grade flutuando na gota de tampão de enxágue colando o braço torcido da pinça anticapilar na gota.
20. Limpe o excesso de tampão suavemente do lado com papel de filtro. Coloque a grade em papel filtro com o lado dourado para baixo, repita as etapas 3,18-3,20 para cada grade e deixe as grades secarem por 15-20 min.
21. Depois que as grades estiverem secas, vire-as para que o lado dourado esteja agora voltado para cima. Evaporar uma fina camada de carbono (aproximadamente 0,5-2 nm de espessura) no lado dourado das grades.
    NOTA: Armazene grades em uma umidade constante, cujo valor não parece importar, observando que várias mudanças na umidade relativa são esperadas para resultar em ciclos de expansão e contração. Permita que as grades envelheçam por 1 semana antes do uso do crio-EM para obter melhores resultados, pois a hidrofobicidade do lado de trás da grade pode ser importante para a estabilidade da monocamada. As grades são estáveis por longos períodos de tempo, mas após 3 meses, o carbono traseiro pode se tornar menos hidrofóbico.

4. Verificação da qualidade do lote da grade de afinidade da estreptavidina por coloração negativa

1. Preparar duas gotas de 50 μL e uma gota de 100 μL de tampão de amostra (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) no lado limpo do parafilme.
2. Remova as grades de trealose e reidrateia estreptavidina tocando as duas gotas de 50 μL e deixe a grade flutuar na gota de 100 μL do tampão de amostra por 10 min.
   NOTA: É melhor evitar o uso de detergente durante a reidratação e subsequentes incubações de ligação de amostras. O tampão se dispersará para o lado dourado das grades e limitará a eficiência das lavagens para remover o excesso de amostras.
3. Após a reidratação, pegue a grade com uma pinça anticapilar para que o braço torcido da pinça anticapilar fique na gota.
4. Limpe suavemente o excesso de tampão para longe do lado e reaplique rapidamente 4 μL da amostra de 75-100 nM (opcional).
   OBS: Evite deixar a grade secar após a reidratação.
5. Incubar a amostra em uma câmara de umidade por 1-5 min.
   NOTA: Os tempos de concentração e incubação serão dependentes da amostra e devem ser otimizados. A concentração da amostra fornecida e o tempo de incubação são pontos de partida sugeridos.
6. No lado limpo do parafilme, colocar quatro gotas de 30 μL cada de tampão de amostra e 1% de coloração de formato de uranila (UF).
   NOTA: Por favor, leia e compreenda as fichas de dados de segurança do fabricante e as instruções recomendadas para o manuseio e descarte do formato de uranila antes de executar esta etapa. O formato de uranila é um composto tóxico e radioativo. Certifique-se de obter aprovação institucional prévia para o uso de materiais radioativos.
7. Lave a amostra não acoplada tocando em cada uma das quatro gotas do tampão da amostra.
8. Manchar a amostra usando procedimentos padrão de coloração negativa com UF. Limpe suavemente a mancha UF do lado, deixando uma camada muito espessa de mancha na grade. Um adicional de 0,5 μL de coloração pode ser aplicado à grade após a mancha para tornar a mancha mais espessa, se necessário. Deixe a grade secar ao ar.
   NOTA: Como as grades de estreptavidina são muito hidrofílicas, a coloração negativa tende a formar uma película muito uniforme em todos os lugares, ao contrário do que é comumente visto quando se usa grades de carbono contínuas tratadas com descarga de brilho. Como resultado, recomenda-se deixar uma película mais espessa de solução de mancha.

5. Congelamento de grades de afinidade por estreptavidina, com amostras biotiniladas

NOTA: O procedimento a seguir destina-se a um êmbolo automatizado unilateral que contém um sensor de blotting interno (também é possível um blotting manual unilateral em outro aparelho de imersão automatizado)

1. Prepare duas gotas de 50 μL e uma gota de 100 μL de tampão de amostra (por exemplo, 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) no lado limpo do parafilme.
2. Hidrate as grades de estreptavidina tocando as duas gotas de 50 μL e deixe a grade flutuar na gota de 100 μL do tampão de amostra por 10 min.
3. Após a reidratação, pegue a grade com uma pinça anticapilar para que o braço torcido da pinça anticapilar fique na gota.
4. Limpe suavemente o excesso de tampão para longe do lado e aplique rapidamente 4 μL de amostra de 75-100 nM.
5. Incubar a amostra numa câmara de humidade durante 1-5 min.
   NOTA: Novamente, os tempos de concentração e incubação serão dependentes da amostra e devem ser otimizados. A concentração da amostra fornecida e o tempo de incubação são pontos de partida sugeridos. Para amostras em baixas concentrações, pode-se incubar por períodos de tempo mais longos e/ou ligar a amostra às grades várias vezes.
6. Prepare duas gotas de 10 μL de tampão de congelamento (por exemplo, 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trealose, 0,01% NP40) no lado limpo do parafilme. Após a incubação, lave a amostra não acoplada tocando a grade até a primeira gota do tampão de congelamento. Solte a grade na segunda gota do buffer de congelamento.
7. Agarre rapidamente a borda da grade com a pinça presa ao êmbolo automatizado unilateral. Elimine suavemente o excesso de tampão e aplique rapidamente 4 μL de tampão de congelamento (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trealose, 0,01% NP40) na grade.
8. Fixe uma pinça ao êmbolo automatizado unilateral. Os melhores resultados foram obtidos usando um sensor de blot que detecta a queda de líquido na grade com tempos de blot entre 4-6 s. As condições variam dependendo da amostra e do buffer usado.

6. Processamento de dados de filmes crio-EM coletados de grades de afinidade com estreptavidina;

A coleta de dados em grades de afinidade por estreptavidina pode ser realizada como com grades padrão, e nenhum ajuste especial ao microscópio é necessário. No entanto, o procedimento detalhado aqui remove o sinal de estreptavidina somente após a correção de movimento da micrografia. Portanto, as etapas de processamento de dados, como o polimento de partículas, que dependem de quadros de filme originais, não podem ser executadas de forma confiável. A subtração do sinal de estreptavidina (necessária para todo o processamento downstream padrão, exceto para a estimativa de CTF) aqui requer Matlab versão R2014b ou mais recente em execução em um ambiente Linux. A subtração do sinal depende da natureza cristalina da camada de estreptavidina, que permite o mascaramento do pico e, portanto, a remoção do sinal da transformada de Fourier de cada micrografia.

1. Configurando os scripts de processamento
   1. Copie todos os arquivos de arquivos suplementares para uma pasta dedicada dentro do diretório do projeto
   2. Prepare um diretório chamado processing_scripts que inclua os seguintes arquivos:
      lsub.m (Arquivo de Codificação Suplementar 1; o script de subtração)
      process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; script wrapper que faz um loop sobre todas as micrografias disponíveis, gera trabalhos paralelos e mantém o controle da entrada e da saída)
      process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; arquivo de configuração que contém os parâmetros para o trabalho de subtração, consulte 6.2)
   3. Prepare um diretório chamado support_scripts que inclui os seguintes arquivos:
      bg_drill_hole.m (Arquivo de codificação suplementar 4)
      bg_FastSubtract_standard.m (Arquivo de codificação suplementar 5)
      bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Arquivo de codificação suplementar 6)
      bg_push_by_rot.m (Arquivo de codificação suplementar 7)
      ReadMRC.m (Arquivo de codificação suplementar 8)
      WriteMRC.m (Arquivo de codificação suplementar 9)
      WriteMRCHeader.m (Arquivo de codificação suplementar 10)
2. Ajuste o arquivo de configuração conforme necessário (process_subtraction.cfg, (consulte a Figura 3) conforme necessário:
   1. Entrada: Caminho para o diretório que contém as micrografias corrigidas por movimento no formato mrc. Use um diretório ou um padrão incluindo curingas (?, *).
      Exemplo:
      input="/caminho/para/project_directory/micrographs/"
      ou
      input="/caminho/para/project_directory/micrographs/*.mrc"
   2. output_dir: Caminho para o diretório no qual as micrografias subtraídas devem ser gravadas.
   3. only_do_unfinished: Especifique (true|false) se as micrografias subtraídas pré-existentes devem ser substituídas ou ignoradas. Esse parâmetro é útil para iniciar o script de subtração de rede no meio de uma sessão de microscópio (padrão: true).
   4. num_parallel_jobs: Especifique o número de trabalhos paralelos. Esse número depende das especificações de hardware usadas para processamento e não deve ser maior do que o número de núcleos disponíveis. Em sistemas com 32 núcleos e um sistema de arquivos de rede, o desempenho ideal foi alcançado com 14 trabalhos paralelos. Para obter o melhor desempenho, otimize esse valor com um subconjunto de micrografias.
   5. Pad_Origin_X: 200 para um detector K3 na orientação retrato (largura da imagem < altura da imagem) ou quando se usa um detector quadrado (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 para um detector K3 na orientação paisagem (largura da imagem > altura da imagem). O FFT é realizado em caixas quadradas e o preenchimento é necessário se o detector tiver dimensões não quadradas.
   6. Pad_Origin_Y: 1000 para um detector K3 na orientação retrato (largura da imagem < altura da imagem), 200 quando se usa um detector quadrado (Falcon III, Falcon IV, K2) ou se se usa um detector K3 na orientação paisagem (largura da imagem > altura da imagem).
   7. Não altere o Inside_Radius_Ang (90) e Outside_Radius_Ang (3.0). A subtração da rede é realizada entre duas resoluções (a unidade está em angstrom).
   8. Pixel_Ang: Forneça o tamanho do pixel como um valor de ponto flutuante.
   9. Limite: valor de corte do limite de subtração para substituir a rede pelo plano de fundo no espaço de Fourier. Os valores usados com sucesso estão entre 1,4-1,6. Use 1.42 como ponto de partida.
   10. Não altere expand_pixel (10) e pad_out_opt (0). expand_pixel é um valor de diâmetro usado para mascarar ao redor de pixels com valores superiores ao ponto de corte do limiar. pad_out_opt é uma opção que decide se uma área acolchoada é incluída na saída.
   11. addpath_m: Caminho para os scripts de suporte.
   12. path_to_matlab_bin: Caminho para o diretório do compartimento de instalação do Matlab do sistema.
   13. path_matlab_script: Caminho para o script de subtração matlab (lsub.m) que foi copiado acima na etapa 6.1.2.
3. Depois de salvar o script modificado, execute o script (bash ./process_subtraction.sh ) para subtrair o sinal de estreptavidina das micrografias de entrada. O script pode ser interrompido e/ou reiniciado se o parâmetro only_do_unfinished estiver definido como true (consulte na etapa 6.2.3). Se ocorrer um erro, revise os parâmetros especificados no script bash. Certifique-se de que não haja espaços não intencionais entre as variáveis de parâmetro e seus valores atribuídos, pois essa é uma fonte comum de erros.
4. Use as imagens subtraídas em rede para o processamento de imagens crio-EM padrão.

Discussion

Nosso protocolo descreve como fazer e usar grades de afinidade de estreptavidina e como processar os dados contendo o sinal de difração de estreptavidina. Existem várias etapas críticas no protocolo que requerem atenção especial.

Lotes de grade malsucedidos podem ser rastreados até vários erros comuns. A fonte mais comum de erro vem do uso de reagentes desatualizados ou de baixa qualidade. É especialmente importante preparar a solução lipídica biotinilada exatamente como descrito no protocolo. Além disso, quaisquer impurezas, como resíduos de detergente no material de laboratório ou óleos naturalmente presentes na pele, podem afetar a qualidade dos cristais de estreptavidina e, portanto, a qualidade das imagens resultantes. Por conseguinte, recomenda-se a realização de três ciclos de lavagem das redes antes da primeira evaporação de carbono para remover uma possível contaminação por tensoactivos do fabricante da rede (passo 2.1). Além disso, a contaminação ou impureza do óleo de mamona tem sido observada para dificultar a formação de cristais na grade.

Fazer e pegar a monocamada lipídica é uma tarefa que deve ser praticada algumas vezes para se ter uma noção dos pequenos volumes lipídicos. Não é incomum que essa etapa falhe nas primeiras duas ou três vezes antes que uma monocamada lipídica adequada possa ser produzida, como se reflete, em última análise, na qualidade dos cristais de estreptavidina, que são vistos em grades coradas negativamente (Figura 4C).

É importante nunca deixar a parte traseira (lado ouro, lado lipídico) da grade ficar molhada durante o processo de fabricação da grade (etapas 3.12-3.20). Caso a parte traseira fique molhada, recomenda-se descartar a grade. Isso pode resultar no aparecimento de grandes vesículas lipídicas que prejudicam a qualidade da imagem (Figura 5D) (Linha 3, Tabela 1). Vesículas lipídicas também podem ser observadas devido à lavagem insuficiente após a aplicação da monocamada lipídica (passo 3.13). Três lavagens subsequentes usando tampão de cristalização são recomendadas após tocar a monocamada lipídica antes da adição de estreptavidina.

Depois que uma fina camada de carbono foi evaporada em grades embutidas em trealose, a parte traseira da grade pode ser molhada sem danificar a qualidade da rede. Por exemplo, a umectação da parte traseira é frequentemente observada quando o tampão da amostra contém quantidades mínimas de detergente. A umectação da parte traseira pela amostra pode resultar na ligação inespecífica das amostras ao filme fino de carbono na parte traseira, o que diminui a eficácia de impedir que as partículas se difundam para a interface ar-água ou o uso de ligação de afinidade para estratégias de purificação on-grid. Se possível, adicione a amostra à grelha na ausência de detergente. Detergente e outros aditivos podem ser posteriormente adicionados durante as etapas de lavagem da grade ou adicionados em uma etapa final antes da vitrificação. Esta é uma limitação ao uso de grades de afinidade estreptavidina; no entanto, se o objetivo é melhorar a orientação preferencial, o preparo da amostra com tampões, incluindo detergente, tem sido realizado com sucesso¹¹.

Uma fonte comum de erro pode ser atribuída à idade das grades em relação a ambas as etapas de evaporação de carbono (passo 2.3 e passo 3.21). Neste protocolo, o período de espera recomendado é de 5-7 dias após a evaporação do carbono no backside antes do uso de grades de estreptavidina para crio-EM. Quando as grades são usadas muito cedo após a fabricação, a rede e a monocamada lipídica foram observadas para se mobilizar para fora dos orifícios da grade. Observação semelhante pode ser feita quando as grades são muito antigas e utilizadas após seis meses (Figura 5A) (Linha 1, Tabela 1). Nós hipotetizamos que esta observação é explicada por mudanças na hidrofobicidade do carbono que é aplicado para estabilizar a monocamada lipídica e cristais de estreptavidina. Além disso, as redes de estreptavidina podem aparecer em mosaico (Figura 5B) (Linha 3, Tabela 1) e quebradas tanto em coloração negativa quanto em crio-ME se a monocamada for aplicada a grades onde a primeira camada de evaporação de carbono (etapa 2.3) não envelheceu suficientemente.

Uma fonte comum adicional de erro pode ser atribuída à fragilidade da monocamada cristalina de estreptavidina (a monocamada lipídica é fluida e pode se expandir ou comprimir reversivelmente). A evaporação de carbono na parte traseira (etapa 3.21) fornece estabilidade crítica à rede de monocamada e estreptavidina durante o processo de adsorção, lavagem e blotting de crio-EM. Na ausência de evaporação de carbono suficiente para a parte posterior da grade, as redes de estreptavidina geralmente aparecerão fragmentadas após o blotting/congelamento (Figura 5C) (Linha 2, Tabela 1). Neste protocolo, sugerimos o uso de um congelador de imersão automatizado unilateral para blotting unilateral. Este método produz condições de blotting altamente reprodutíveis que preservam a rede de estreptavidina durante o processo de congelamento e permitem a otimização simplificada da aplicação da amostra e dos parâmetros de blotting. Alternativamente, outros equipamentos automatizados de congelamento de imersão têm sido usados em combinação com o blotting manual. Para fazer isso, a função de blotting real é desativada nas configurações do dispositivo, e a grade é manchada em vez disso, alcançando com um par de pinças segurando papel de mancha através da entrada lateral. Este método pode obter resultados de alta qualidade para laboratórios sem um dispositivo de congelamento de blotting e imersão unilateral; no entanto, a reprodutibilidade grid-to-grid é um desafio.

Embora o uso de grades de afinidade com estreptavidina tenha muitas vantagens, algumas limitações desse método precisam ser levadas em consideração. Devido à natureza do procedimento, geralmente não é possível avaliar a qualidade da rede de estreptavidina até que todo o processo tenha sido concluído. Sugere-se selecionar rapidamente a qualidade de cada lote por coloração negativa antes de congelar as amostras. Devido ao sinal contribuído pela rede estreptavidina para as imagens brutas, pode ser desafiador em alguns casos avaliar, apenas a partir das imagens, se há um número suficiente de partículas intactas e dispersas. Pela mesma razão, o processamento em tempo real de dados crio-EM durante a aquisição de dados não é possível, a menos que o procedimento de subtração do sinal de estreptavidina tenha sido incluído no pipeline de pré-processamento de dados. Como o sinal de estreptavidina é geralmente subtraído das imagens corrigidas por movimento e não dos quadros em si, o polimento bayesiano, como implementado em suítes de software populares, pode falhar ao usar os procedimentos de subtração conforme descrito. Recomenda-se, portanto, a correção do movimento em múltiplos remendos para minimizar o movimento das partículas desde o início do processamento dos dados¹⁶.

Apesar dessas limitações, as grades de afinidade com estreptavidina oferecem muitas vantagens. Duas grandes vantagens que as grades de afinidade de estreptavidina fornecem sobre as grades crio-EM de orifício aberto padrão são um meio de proteger as amostras da interface ar-água e concentrar amostras de baixa abundância (10-100 nM) na grade. Outras camadas de suporte, como o carbono e o óxido de grafeno, também podem ser usadas como estratégias para superar esses gargalos de preparação de amostras. Em um exemplo, grades de afinidade de estreptavidina foram a única solução para obter uma reconstrução intacta de uma interação proteína-ácido nucleico que era incompatível com abordagens de reticulação. ^12º

Outra grande vantagem que as grades de afinidade com estreptavidina proporcionam é uma solução para amostras que adsorvem a outras camadas de suporte, como óxido de carbono ou grafeno, com orientações preferenciais que dificultam a capacidade de obter uma reconstrução 3D da amostra de interesse. A biotinilação aleatória de amostras usando kits comercialmente disponíveis permite a fixação aleatória da amostra de interesse à monocamada de estreptavidina, a fim de obter mais visualizações potenciais para superar este desafio.

Além disso, as grades de afinidade estreptavidina, oferecem vantagens exclusivas das grades baseadas em afinidade. A alta afinidade e especificidade da interação estreptavidina-biotina permitem o acoplamento de grades de afinidade de estreptavidina com outros fluxos de trabalho que envolvem biotina para purificar complexos de interesse. Em um exemplo publicado, os autores imobilizaram um complexo em grades de afinidade de estreptavidina, e incubaram um parceiro de ligação de estequiometria desconhecida em grande excesso. Após a lavagem de qualquer proteína não ligada, o supercomplexo corretamente montado foi obtido e imediatamente analisado com crio-EM¹¹. Uma possível aplicação futura pode ser combinar etiquetas proteicas ligadoras de estreptavidina, o sistema Avi-tag ou abordagens de marcação por proximidade com grades de afinidade por estreptavidina, para extrair proteínas individuais e/ou complexos proteicos diretamente de fontes recombinantes ou endógenas sem esquemas de purificação elaborados padrão.

Ao fornecer este protocolo, os laboratórios devem ser capazes de reproduzir facilmente a fabricação de grades de afinidade por estreptavidina, estabelecendo-as como uma ferramenta mais comumente usada para análise estrutural de complexos proteicos por crio-EM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt	Avanti Polar Lipids	870285P	Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL  in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C
200 proof pure ethanol	Fisher Scientific	07-678-005
5 μL Hamilton Syringe	Hamilton	87930	5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2
Castor Oil	Sigma Adrich	259853
Cell culture dishes untreated (35 mm)	Bio Basic	SP22146
Chloroform	Sigma Aldrich	650471
D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99%	Sigma Aldrich	T9449
DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade	Ted Pella	510-5NM
HPLC Grade Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater	Leica
Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer	Leica
Quantifoil R 2/1 Au300	Quantifoil	Q84994
Steptavidin	New England Bioscience	N7021S	Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots
Talcum powder	Carolina	896060
Whatman Grade 1 filter paper	Cytiva	1001-085