В протоколе описана индукция волосистых корней с использованием первичных стеблей соцветий арабидопсиса и гипокотилей Brassica napus . Волосистые корни могут быть культивированы и использованы в качестве эксплантов для регенерации трансгенных растений.
Волосистая трансформация корня представляет собой универсальный инструмент для биотехнологии растений у различных видов. Заражение штаммом Agrobacterium , несущим корнеиндуцирующую плазмиду (Ri), индуцирует образование волосистых корней в месте раны после переноса Т-ДНК из плазмиды Ri в геном растения. В протоколе подробно описана процедура инъекционной индукции волосистого корня у Brassica napus DH12075 и Arabidopsis thaliana Col-0. Волосистые корни могут быть использованы для анализа интересующего трансгена или обработаны для получения трансгенных растений. Среда регенерации, содержащая цитокинин-6-бензиламинопурин (5 мг/л) и ауксин 1-нафталинуксусную кислоту (8 мг/л), успешно вызывает побегообразование у обоих видов. Протокол охватывает генотипирование и селекцию регенерантов и растений Т1 для получения растений, несущих интересующий трансген и свободных от Т-ДНК из плазмиды Ri . Также изображен альтернативный процесс, приводящий к образованию композитного завода. В этом случае волосистые корни сохраняются на побеге (вместо естественных корней), что позволяет изучать трансген в волосистых корневых культурах в разрезе всего растения.
Трансформация растений является узким местом любого генетического исследования в биологии растений. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens широко используется в качестве средства для доставки генов с помощью цветочного соуса или культуры тканей для получения трансформантов. A. tumefaciens инфицирует растения в месте раны и вызывает опухоли из-за переноса и интеграции Т-ДНК из плазмиды, индуцирующей опухоль (Ti), в геном растения-хозяина. В качествеэффективной системы трансформации растений обычно используют сконструированные штаммы A. tumefaciens с модифицированной Ti-плазмидой без Т-ДНК дикого типа и бинарный вектор с искусственной Т-ДНК и сайтами клонирования для вставки интересующего гена. Тем не менее, многие модельные виды и культуры не поддаются регенерации растений или регенерации in vitro или имеют длительные циклы роста, что влияет на эффективность этой системы трансформации.
Agrobacterium rhizogenes вызывает образование придаточных корней, или волосистых корней, в месте поражения после заражения растения-хозяина. Подобно A. tumefaciens, A. rhizogenes переносит Т-ДНК из корнеиндуцирующей плазмиды (Ri) в геном растения-хозяина, вызывая развитие трансгенных волосистых корней. Этот процесс контролируется в основном генами корневых онкогенных локусов (ROL) 2,3. Используя агробактериальные штаммы, несущие как плазмиду Ri, так и искусственный бинарный вектор, кодирующий интересующий ген, культуры волосатых корней были использованы для получения рекомбинантных белков, анализа функции промоторов или генов или редактирования геномов с использованием кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9)4,5,6.
В нашем протоколе используется трансконъюгантный штамм Ti-less A. tumefaciens C58C1, несущий плазмиду Ri pRiA4b7. Т-ДНК плазмиды Ri состоит из двух участков, правой и левой Т-ДНК (TR-ДНК и TL-ДНК соответственно), которые могут независимо интегрироваться в геном растения8. Использование этой системыпозволило оптимизировать длительный процесс трансформации эксплантов в сорте Brassica napus DH12075 9. Протокол, подробно описанный ниже, позволяет осуществить регенерацию выбранных волосистых корневых линий и получить растения Т1, несущие интересующий трансген и свободные от генов rol, примерно за 1 год. Инъекционная трансформация волосистого корня может быть использована и для других видов Brassicaceae, как показано на примере трансформации Arabidopsis thaliana Col-0. В то время как гипокотиль используется для трансформации B. napus, A. thaliana вводится в основной стебель соцветия.
1. Приготовление сред и растворов
2. Трансформация агробактерии бинарным вектором
3. Волосистая трансформация корня Brassica napus DH12075
4. Регенерация Brassica napus DH12075 волосистыми корнями
5. Выбор регенеранта и установки Т1
ПРИМЕЧАНИЕ: Волосистые корневые линии могут быть выбраны до начала процесса регенерации. Тип отбора зависит от содержания, переносимого трансгеном. Волосистые корни могут быть отобраны для экстракции ДНК и генотипирования или выявления мутаций, экстракции РНК с последующим синтезом кДНК и ОТ-кПЦР для анализа на уровне экспрессии гена выбора, микроскопии для обнаружения флуоресценции или обработаны для окрашивания ГУС.
6. Трансформация и регенерация волосистых корней у Arabidopsis thaliana Col-0
Ранее мы оптимизировали протокол индукции волосистого корня на основе инъекций у трех сортов Brassica napus, а именно DH12075, Topas DH4079 и Westar9. Для применения этого протокола трансформации к модельному виду A. thaliana первичным стеблям соцветий 1-месячных сеянцев вводили агробактериальный инокулюм. Волосистые корни появились на месте инъекции через 2-4 недели. Волосистые корни иссекали и культивировали на твердой среде. Сравнение метода у этих двух видов изображено на рисунке 1.
Отобранные волосистые корневые линии переносили в среду регенерации, чтобы стимулировать образование побегов. У A. thaliana желтые каллусы индуцировались в течение 14 дней во всех 10 исследованных волосистых корневых линиях. Зачатки первых побегов видны в виде темно-зеленых пятен, появившихся в течение 3 недель после переноса в среду регенерации (рис. 2). Через 4 недели культуры побеги покрыли волосистые корни в 9 из 10 волосистых корневых линий (эффективность регенерации 90%). В некоторых случаях из каллуса выделялись придаточные корни (рис. 2H). Одна линия не регенерировала даже через 3 месяца на среде Regeneration (каждые 4 недели волосистые корни пересаживались на свежую среду). Таким образом, эффективность регенерации волосистых корней A. thaliana сходна с эффективностью B. napus DH120759.
Волосистые корневые регенеранты B. napus и A. thaliana демонстрируют карликовый фенотип (рис. 3), что является типичной чертой волосистых корневых растений2. Мы также наблюдали густую корневую систему, морщинистые листья и изменения во времени цветения. Этот так называемый фенотип волосистого корня (или Ri) обусловлен генами rol плазмиды Ri , вставленными в геном растения. Вставка Ri Т-ДНК и трансгена, кодируемого на бинарном векторе, может быть независимой или сцепленной. Таким образом, сегрегационный анализ потомства Т1, созданного путем самоопыления, помогает идентифицировать растения без рулонов, экспрессирующие интересующий трансген. Генотипирование растений Т1 проводят с помощью ПЦР-праймеров, специфичных для ORF TL и TR и интересующего трансгена. Отсутствие агробактериальной обсемененности проверяется отсутствием продуктов ПЦР праймеров virC (рис. 1).
Рисунок 1: Краткое описание процедуры у A. thaliana и B. napus. Инъекция Agrobacterium inoculum в стебель гипокотиля или первичного соцветия вызывает развитие волосистых корней. Волосатые корни могут заменить родные корни, чтобы создать сложное растение, которое будет генотипировано и проанализировано (синие стрелки). Культивируемые волосистые корни могут быть регенерированы в растения Т0, размножаться в растениях Т1 и генотипированы (зеленые стрелки). Волосатые корни также могут быть субкультивированы для функционального анализа (черная стрелка). Приведены примеры результатов генотипирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Регенерация волосистых корней у A. thaliana. (А) Волосистая корневая культура через 1 сутки после ее переноса на пластины. (В, В) Каллусы развивались в течение 2 недель культивирования на регенерационной среде. (Г, Д) Побег зачатков появился через 3 недели культивирования. (Г, Н) Всходы образуются через 4 недели. (H) Придаточные корни развились из каллуса. (С, Ж, И) Нерегенерирующая волосистая корневая линия. Масштабные линейки обозначают 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные фотографии дикорастущих растений B. napus и A. thaliana и регенерантов с волосистыми корнями (растения T0). Обратите внимание на фенотип Ри регенерантов. Масштабные линейки обозначают 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Мы разработали простой протокол трансформации волосистого корня и последующей регенерации у B. napus и A. thaliana. Этот процесс включает в себя инъекционную индукцию волосистого корня в гипокотиль (B. napus) или первичный стебель соцветия (A. thaliana). Метод введения в гипокотиль агробактериального штамма C58C1, несущего плазмиду Ri, был эффективен также в семействе Fabaceae10,11, помимо представителей семейства Brassicaceae, представленных в данном исследовании.
Альтернативой инъекционному методу является иммерсионная трансформация, состоящая из погружения экспланта в бактериальную суспензию с последующим совместным культивированием экспланта с агробактериями. Преимущество инъекционного метода перед иммерсионным заключается в экономии времени за счет отсутствия некоторых протокольных этапов: подготовки экспланта, теста времени совместного культивирования и культивирования на среде, содержащей гормон для индукции волосистых корней. Несмотря на то, что оба подхода эффективны для индукции волосистого корня, у некоторых видов наблюдалась более высокая эффективность трансформации при инъекционном методе по сравнению с эксплант-иммерсионным12,13. Кроме того, инъекционная трансформация также полезна для получения сложных растений (трансгенных волосистых корней и побегов дикого типа). После отрезания первоначальных корней трансформированного растения волосистые корни поддерживают рост растения, и трансген может быть изучен в контексте всего растения.
Критическим этапом индукции волосистого корня является введение посевного материала в гипокотиль, или первичный стебель соцветия. Гипокотили B. napus хрупкие, и разрезание всего гипокотиля может легко произойти. То же самое можно наблюдать и с A. thaliana из-за тонкости стебля соцветия. Если требуется сравнение эффективности трансформации разных видов/сортов, мы рекомендуем одному человеку проводить все эксперименты, чтобы избежать ошибки, вызванной манипуляциями и навыками введения растений.
Разработан эффективный протокол регенерации волосистых корней у B. napus DH12075 и A. thaliana Col-0. Поскольку регенерация является очень изменчивым процессом, некоторые модификации протокола могут быть применены к выбранному виду или сорту. Например, волосистые корневые побеги могут быть вызваны другим соотношением ауксин/цитокинин (1:1) у B. oleracea14. В качестве альтернативы вместо БАТ можно использовать цитокинин тидиазурон, например, в случае волосистых корней B. campestris 15.
Множественные вставки Т-ДНК плазмиды Ri в геном растения представляют собой потенциальное ограничение системы трансформации и регенерации корня волоса. В таких случаях после сегрегационного анализа проростков Т1 не обнаруживается ни одного растения, свободного от TL/TR из плазмиды Ри. Таким образом, мы рекомендуем генерировать несколько независимых волосистых корневых линий для каждого трансгена.
Волосистые корневые культуры являются чрезвычайно мощным инструментом для функциональных исследований генов, главным образом из-за их быстрого укоренения и дешевого обслуживания (в питательных средах не требуются гормоны). Этот протокол охватывает методы индукции и регенерации волосистых корней у B. napus и A. thaliana, которые могут быть использованы для изучения интересующего трансгена непосредственно в волосистых корневых культурах, в контексте всего растения с использованием сложных растений или после регенерации трансгенных растений.
Выражаем благодарность Йиржи Макасу (Jiří Macas) (Биологический центр CAS, Ческе-Будеёвице, Чешская Республика) за предоставление агробактериального штамма. Отдел наук о базовых установках CEITEC MU получил признание за свою техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики совместно с Европейским фондом регионального развития-проектом «ПОЮЩЕЕ РАСТЕНИЕ» (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) и проект INTER-COST LTC20004.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
3M micropore tape | Micropore | ||
6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
70% ethanol | |||
bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
Bottles | DURAN | L300025 | |
Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
chloroform | Serva | 3955301 | |
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
elctroporation cuvette | |||
electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
ethidium bromide | AppliChem | ||
Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
glycerol | Sigma | G5516-1L | |
HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
Measuring cylinder | |||
MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
pH meter | |||
Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
Retsh mill | Qiagen | ||
sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
thermomixer | Eppendorf | ||
Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved